支气管哮喘是儿童时期呼吸系统常见的疾病之一,以气道慢性炎症、气道高反应性和气道结构的重塑为基本病理特征,其发病机制复杂,主要考虑和机体自身免疫反应异常应答相关,但目前尚未完全阐明。支气管哮喘的发病机制主要集中于Thl/Th2细胞分化失衡后引起的一系列异常免疫应答。Thl、Th2细胞的分化方向及分泌功能已逐步被人了解,但其刺激分化的分子机制尚未完全清楚。T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin mucin protein,TIM)基因家族是新近发现的哮喘易感基因家族成员,因其转录蛋白最早被发现表达于T淋巴细胞表面,故而得此名。研究表明,TIM蛋白具有双向调节T细胞分化的作用。TIM-4仅表达于抗原提呈细胞表面,如树突状细胞、巨噬细胞等,包括四个区段。研究证实其与免疫性疾病如肿瘤免疫耐受、肾脏缺血再灌注损伤及支气管哮喘等有密切关系,但对其发挥生物学效应的具体机制尚未完全明确。1,25-(OH)2D3是维生素D3的活性代谢产物,除骨钙调节作用外,还调节着机体自身免疫反应。其免疫调节作用亦主要通过改变树突状细胞及单核细胞的活性来实现。目前关于1,25-(OH)2D3对哮喘患儿的保护作用,在流行病学调查及临床实践中,已得到证实,但其明确的机制原理,尚未明确。本研究通过建立哮喘小鼠气道重塑模型,使用1,25-(OH)2D3腹腔注射进行干预治疗,观察哮喘小鼠气道重塑改善情况及TIM-4蛋白及mRNA表达改变,从而更深入挖掘哮喘的发病机制,为哮喘的治疗寻找新的靶点。目的在哮喘小鼠气道重塑模型上,使用1,25-(OH)2D3腹腔注射,进行干预治疗,测量治疗后哮喘小鼠气道壁厚度,与哮喘组比较是否有所好转；测定肺组织内TM-4表达量的改变。旨在从新的角度分析哮喘发病机制,为哮喘的治疗开辟道路。材料和方法1实验动物分组及哮喘模型制备30只雌性、健康、8周龄的BALB/c系小鼠,适应性饲养1周后,按照随机原则将小鼠分为对照组、哮喘组和1,25-(OH)2D3干预组,每组10只,制备动物模型。模型致敏阶段：哮喘组及1,25-(OH)2D3干预组小鼠在实验的第1、8、15天分别给予腹腔注射抗原混合液0.2mL(含OVA50μg、10%氢氧化铝0.15mL和生理盐水0.05mL),对照组则给予0.2mL生理盐水代替。模型激发阶段：哮喘组及1,25-(OH)2D3干预组小鼠分别于实验的第22天在自制玻璃容器中给予雾化吸入1%OVA溶液(5mL)进行激发,1次／天,30min/次,持续雾化14次,至实验第35天结束,对照组以生理盐水取代OVA雾化吸入。模型干预治疗：1,25-(OH)2D3干预组于雾化激发前30min给予腹腔注射1,25-(OH)2D3混合液0.1mL(含1,25-(OH)2D30.1ug、无水乙醇2.5μL、生理盐水0.1mL),哮喘组及对照组小鼠均以等剂量生理盐水替代1,25-(OH)2D3混合液。2肺组织标本的制备末次雾化结束后24小时内,采用乙醚吸入麻醉各组小鼠,将小鼠固定于操作台上,开胸,暴露小鼠肺组织及心脏,结扎左侧肺门,取出左肺,冻存于液氮,转存至-80℃冰箱内,留做RT-PCT检测标本；迅速经右心室插管至肺动脉,用大量生理盐水快速冲洗肺组织至肺叶颜色呈白色,无血液样物质流出时,换4%甲醛溶液冲洗进行内固定,剪断支气管取出右肺组织及心脏,摘取右肺中叶,置于4%甲醛溶液中避光进行外固定48h以上,石蜡包埋,3μm厚度切片,用于HE染色及免疫组织化学染色。3HE染色石蜡切片后,将切片置于二甲苯溶液中常规脱蜡后,进行苏木精-伊红染色,显微镜下观察支气管壁形态学改变及周围炎症细胞浸润情况,测定同等级别支气管壁厚度,比较气道重塑情况。4免疫组化染色将已切片好的3μm厚度的石蜡切片放入60℃恒温烤箱中进行烘烤,时间设定2小时,结束后取出自然冷却,放入二甲苯溶液中重复脱蜡2次,浓度逐渐下降的乙醇溶液中浸泡使肺组织标本水化,蒸馏水冲洗、PBS液冲洗后,加入抗原修复液进行修复,而后在切片上依次滴加山羊抗小鼠一抗、二抗、辣根酶标记的链霉卵白素、DBA显色、苏木素复染、盐酸分化,而后脱水封片,进行免疫组化操作。应用计算机病理图像分析系统在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下观察并测定阳性细胞中蛋白的表达。每张切片选取5个以上高倍镜视野,取平均值做为该片的蛋白半定量结果。5RT-PCR检测TIM-4mRNA表达取黄豆大小冻存的左肺肺组织,用Trizol提取总RNA,加入逆转录试剂后,在RT-PCR扩增仪中合成单链cDNA,加入已设计引物,扩增目的基因。TIM-4(PCR产物为291bp)上游引物为：5’-CAATCGAGGTGACAGTGGG-3’下游引物为：5’-AAGGAGCCAGGTGTTGTTG-3’;退火温度58℃。内参(PCR产物为549bp)上游引物：5’-ATCACTGTCTTCCAGGAGC-3’下游引物：5-’ATCATACTTGGCAG GTTTCT-3’;退火温度52℃。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳,并采用凝胶电泳成像系统观察目的基因,并测定目的基因的灰度值。6统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组计量资料均采用均数±标准差(X±S)表示,组间差异性分析采用单因素方差分析、LSD-t检验,以α=0.05为检验标准。结果1各组小鼠病理形态学改变在普通光学显微镜高倍镜(10×40)下观察：哮喘组小鼠支气管壁增厚、受损,管腔狭窄变形,可见大量粘液分泌,平滑肌层增厚,杯状细胞化生,上皮细胞脱落,支气管壁周围及血管壁周围炎性细胞浸润增多。1,25-(OH)2D3干预组小鼠亦出现上述变化,较哮喘组有所减轻,支气管壁厚度较哮喘组明显变薄。对照组小鼠气管壁结构完整光滑,上皮细胞排列整齐,无杯状细胞化生,气道壁厚度正常。各组间支气管壁厚度的两两比较,差异有统计学意义。2各组小鼠免疫组化结果免疫组化染色后,TIM-4呈棕黄色,主要存在于肺泡间质、支气管壁及血管周围。哮喘组小鼠中可见大量TIM-4黄染颗粒,呈强阳性表达；1,25-(OH)2D3干预组较哮喘组表达有所减弱,对照组仅少量黄染颗粒,呈弱阳性。各组间比较,差异具有统计学意义。3各组小鼠肺组织内TIM-4mRNA检测结果RT-PCR电泳结果是哮喘组亮度最强,其定量灰度均值为0.650±0.023,干预组亮度弱于哮喘组,强于对照组,其灰度值为0.435±0.020,对照组为0.105±0.011各组间比较有差异,且差异有统计学意义。结论1.1,25-(OH)2D3通过下调TIM-4的表达来降低哮喘发作的严重程度,减轻气道炎症反应,改善气道重塑。2.1,25-(OH)2D3可望成为哮喘新的辅助治疗药物。