禽波氏杆菌病是一种新型细菌性传染病,其病原体为禽波氏杆菌,主要造成雏禽的呼吸道疾病,引起急性死亡。患病鸡群生长缓慢,饲料报酬率低,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前国内外用于预防该病所用的疫苗主要有禽波氏杆菌温度敏感株和全细胞菌素,但疫苗保护效果一般,仅能适当降低病变的严重程度或延缓临床症状的出现,亟待研发新型疫苗。而DNA疫苗是一种最新的分子水平的生物技术疫苗,能够同时诱导机体产生全面的体液免疫反应和细胞免疫反应,因此在实践应用中备受人们关注。此外,本实验室从2003年开始对泰山松花粉多糖(TPPPS)进行了一系列的研究,发现泰山松花粉多糖作为疫苗佐剂能够显著提高灭活疫苗和亚单位疫苗的免疫效果,然而以泰山松花粉多糖作为DNA疫苗佐剂尚未被研究。因此,为研发新型有效的禽波氏杆菌疫苗,本课题选取禽波氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因为目的基因构建真核重组表达质粒并制备DNA疫苗。为提高DNA疫苗的免疫效果,我们选取泰山松花粉多糖作为疫苗佐剂同时评估其对DNA疫苗的免疫调节作用。根据NCBI发表的禽波氏杆菌OmpA基因设计一对特异性引物,对实验室分离得到的禽波氏杆菌菌株的OmpA基因进行PCR扩增并连接到pMD18-T质粒,转化并送至测序公司测序。用EcoR I与Xho I酶切处理pMD18-T-OmpA质粒获得OmpA基因并将得到的OmpA基因连接到已用EcoR I与Xho I处理的pVAX1质粒上,将重组质粒进行双酶切检测与测序。将验证构建正确的重组真核质粒pVAX1-OmpA转染BHK-21细胞,72 h后收获细胞上清液获得表达的OmpA蛋白。将获得的OmpA蛋白通过His标签镍柱层析法进行纯化,纯化的OmpA蛋白的SDS-PAGE分析显示目的条带大小约为27 KD,与预期结果相符。同时,OmpA蛋白的Western blotting鉴定可清晰地看见约27 KD大小的特异性条带,与其SDS-PAGE分析结果相一致。依照本实验室改进的水提醇沉法提取泰山松花粉多糖,并将大量提取的重组质粒与泰山松花粉多糖或弗氏不完全佐剂等体积配比制备疫苗。将224只1日龄SPF雏鸡随机分为7组,于1、7、14日龄时,每组每只雏鸡分别注射等量的3个不同多糖浓度(50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL)的DNA疫苗、弗氏佐剂DNA疫苗、纯DNA疫苗、空质粒和PBS。在首次免疫后的第7、14、21、28、35、42、49天每组随机选取3只雏鸡采血检测其血清抗体效价、白细胞介素-2(IL-2)含量、白细胞介素-4(IL-4)含量、干扰素-γ(IFN-γ)含量,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞数量水平。同时,在三次加强免疫后每组随机选取20只进行攻毒保护试验,连续7天记录鸡群生存状态并统计免疫保护率。结果显示,禽波氏杆菌OmpA DNA疫苗能够刺激机体产生特异性抗体、提高细胞因子分泌量和外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞数,并为雏鸡提供50%的免疫保护。另外,泰山松花粉多糖和弗氏佐剂能够显著提高雏鸡体液免疫和细胞免疫水平且200 mg/mL的松花粉多糖效果最优(P<0.05)。