酰胺酶(EC 3.5.1.4)作为腈转化酶家族中重要一员,由于其广泛的底物谱、专一立体选择性,在制备手性药物和农用化学品中间体中具有广阔应用前景。在腈水合酶/酰胺酶的双酶体系中,立体选择性主要产生于酰胺水解反应。本实验室已经利用Delftia tsuruhatensisZJB-05174酰胺酶选择性地水解R-2,2-二甲基环丙甲酰胺动力学拆分得到西司他丁关键中间体——S-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺。而对该酰胺酶立体选择性的调控研究,有利于构建以腈水合酶/光学选择性酰胺酶为基础的生物催化法制备手性药物和农用化学品中间体的技术平台。本文先利用分子生物学手段克隆到来自Delftia tsuruhatensis ZJB-05174酰胺酶基因,并将其在重组大肠杆菌中高效表达,再围绕酰胺酶的催化特性及立体选择性进行研究,为其工业化应用提供理论基础。以 D.tsuruhatensis ZJB-05174全基因组为模板,利用PCR方法获得了大小为1401 bp的酰胺酶基因。将该基因连接到表达载体pET-28b,转化E.coli BL21(DE3),成功构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-amidase。重组菌经IPTG诱导表达能高效表达酰胺酶,SDS-PAGE分析酰胺酶分子量约50kDa。对分离纯化后的重组酶进行活力测定,表明其对2,2-二甲基环丙甲酰胺的比酶活力为52.4 U/mg。测定重组酶对不同酰胺底物反应的Km和Vmax,以此为基础阐述了酰胺酶的底物特异性。结果表明蛋氨酰胺、正丁酰胺等脂肪族酰胺的Km较芳香族和杂环族小;且苯环或杂环上的H被较大的基团取代所产生的空间位阻效应会导致该酰胺酶对芳香族和杂环族酰胺的活力降低。酰胺酶热失活动力学研究表明其失活过程符合非一级失活动力学。通过显色法测定该酰胺酶催化烟酰胺酰基转移反应乒乓动力学常数为:Kamide=16.5mM,KNH2OH=20.9mM,表明该酰胺酶更容易结合酰胺而非共底物羟胺。以2,2-二甲基环丙甲酰胺为底物,温度由30 ℃升高到60℃,eep由95.1%降低至-71.40%;以扁桃酰胺为底物,温度由30℃升高到55℃,eep由90.8%下降至57.5%;以2-苯基丁酰胺为底物时,eep也由原来的99.2%降低至-11.5%;未经热处理的酰胺酶催化2,2-二甲基环丙甲酰胺酰基转移反应的%可达90%,而55℃处理7 min后下降至17%,处理8 min后降低至-4%。通过温度调节酰胺酶催化三种手性酰胺底物的立体选择性结果表明:该酰胺酶的立体选择性催化过程是受温度调控的(当温度升高时,酶的立体选择性降低;当温度降低时,酶的立体选择性升高)。对2,2-二甲基环丙甲酰胺和2-苯基丁酰胺而言,温度升高可以“反转”该酰胺酶对其选择性,由原来的R型选择性转变为S型。但对扁桃酰胺而言,选择性不可“反转”(说明了“反转”现象并不是一个普遍的规律)。