在器官移植领域,虽然目前移植技术已基本攻克,但是排斥反应仍然是移植医生和病人面临的最大问题,也是移植物长期存活的最大障碍。术后长期或终身服用免疫抑制剂是预防排斥反应的主要手段,所以必须进行移植术后免疫状态的监测。目前免疫状态的监测主要包括受体全身情况的评估、移植肾功能状态的测定、移植物组织病理学的检查、免疫抑制剂的血药浓度监测及受体免疫系统的评估等几个方面。受体全身情况的评估和移植肾功能状态的改变具有非特异性,感染等其他并发症也可能导致上述情况的发生,因此只能作为调整免疫用药的参考。移植物组织穿刺病理学检查无疑是判定排斥存在与否的最准确方法,但是肾穿刺活检是一种有创性检查,可能发生穿刺相关并发症,不易反复监测。免疫抑制剂血药浓度的监测是目前评估免疫状态、调整临床用药的主要依据,在预防和治疗急性排斥反应中发挥了重要的作用。但由于个体药代动力学的差异和影响免疫功能因素的复杂性,许多病人仍难以完全避免排斥反应的发生。淋巴细胞计数、淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8细胞比例是评估受体免疫状态简单而实用的方法,但是淋巴细胞计数无特异性。因此,必需进行T细胞各种亚型的分析,才能有助于判定免疫状态,预示急性排斥反应的发生。目前主要存在的问题是没有一个定量的指标能确定细胞因子浓度升高到何种水平时与排斥的发生有关。而且细胞因子通过网络彼此互相影响,水平波动较大。器官移植的排斥反应主要是细胞免疫,起关键作用的细胞是CD4+T细胞。大多免疫抑制检测和免疫抑制治疗都是以CD4+T细胞作为主要研究目标。免疫细胞的功能直接或间接依赖于细胞内ATP的能量供应,所以测定细胞内ATP的浓度可以反映免疫细胞的功能状态。三磷酸腺苷生物发光法(ATP-CVA)是一种敏感性很高的进行ATP定量分析的方法,其基本原理是在ATP的参与下,虫荧光素酶催化它的小分子底物——虫荧光素氧化,将化学能转化为可见光,用照度计测得的相关光单位(RLU)与ATP浓度呈线性关系,通过标准曲线可以得出检验样本中的ATP浓度。本课题应用ATP-CVA法检测植物血凝素(PHA)刺激后CD4+T细胞内ATP的浓度来反映免疫细胞功能。通过对肾移植病人的细胞免疫(CMI)功能进行动态监测,观察肾移植患者术前和术后4周及发生急性排斥反应、巨细胞病毒性肺炎时及治疗后的细胞免疫功能状态,了解移植患者术后免疫状态的变化情况及在预示排斥反应、巨细胞病毒性肺炎中的作用。本课题旨在探讨ATP-CVA法在临床应用的可行性及其在评估肾移植术后免疫状态、指导临床用药、预示急性排斥反应、巨细胞病毒性肺炎和实施个体化免疫治疗中的作用。[目的]1.探讨ATP-CVA法检测肾移植术后患者免疫状态在临床应用中的可行性。2.采用ATP-CVA法动态监测肾移植患者CD4+T细胞经PHA刺激后ATP值的变化趋势,了解肾移植术后患者的细胞免疫功能状态。3.通过ATP-CVA法动态监测肾移植患者发生急性排斥反应、巨细胞病毒性肺炎时及治疗后的细胞免疫功能状态,了解移植患者术后免疫状态的变化情况及在预示排斥反应、巨细胞病毒性肺炎中的作用。[方法]1. ATP标准曲线的制定1.1取ATP标准品lmg,用RMPI-1640培养基稀释成系列浓度106、105、104、103、102、10、lng／ml;1.2稀释后的ATP与ImmuKnowTM-Cylex荧光试剂混合后,用照度计检测产生的荧光；1.3 ATP值与RLU取1g,制定标准曲线。2.细胞免疫功能监测采用ATP-CVA法对30例正常健康人群和90例肾移植手术病人(术前和术后1、2、3、4周)的全血样本进行免疫细胞功能检测。发生急性排斥和巨细胞病毒性的病人进行治疗前后的监测。具体检测步骤如下：2.1稀释的全血样本放在96微孔板中与PHA-L孵育15-18小时；2.2应用带有抗CD4单克隆抗体的磁珠分离CD4+T细胞;2.3 ImmuKnowTM-Cylex荧光试剂与分离的细胞混合,使细胞裂解释放出ATP并与试剂中的虫荧光素、荧光素酶发生反应；2.4照度计检测产生的荧光,对照ATP标准曲线得出ATP的浓度。[结果]1.当ATP浓度在100-104ng／ml之间时,与RLU呈直线关系。直线方程为Y=0.75X+2.37(r=0.99452)；2.1通过4周的连续随访,30例志愿者的CD4+T淋巴细胞ATP水平较为稳定,1-4周分别为：(437.25±56.16)ng／ml、(402.38±64.09)ng／ml、(436.95±67.057)ng／ml、(443.84±82.25)ng／ml。四周的ATP值经方差分析,组间差异无统计学意义(P>0.05),将数据90%置信区间检测分析认为正常人群的CD4+T淋巴细胞ATP水平为320ng/ml-520ng/ml。2.2通过年龄进行分组分析,以联合国世界卫生组织年龄段划分：44岁为年龄分层标准,超过44岁的健康者为4人,随访4周的CD4+T淋巴细胞ATP水平为(389.39±11.10)ng/ml,其余为小于44岁者随访4周的CD4+T淋巴细胞ATP水平为(436.37±36.05) ng/ml。两年龄组进行wilcoxon秩和检验,其差异有统计学意义(P<0.05)。2.3通过性别进行分组分析,其中男性健康者19人,随访4周的CD4+T淋巴细胞ATP水平为(438.11±36.37)ng／ml,女性健康者为11人随访4周的CD4+T淋巴细胞ATP水平为(416.28±36.59)ng／ml。女性人群较男性人群稍低,但经成组t检验,男女两组的组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.肾移植受者术前CD4+T细胞ATP浓度为(398.17±108.21)ng／ml,明显低于对照组(437.25±56.16)ng／ml,经成组t检验,两组差异有统计学意义(P<0.05)。术后1周左右降至最低,采用抗体诱导者尤其明显,同期与未采用抗体诱导组比较其差异有统计学意义(P<0.05),4周时CD4+T细胞ATP浓度为(329.64±67.57)ng／ml仍低于术前水平,21例抗体诱导者回升相对较慢,同期与未采用抗体诱导组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。4.7例受者出现急性排斥反应,其术前,术后1周,急性排斥出现时,治疗后1周,治疗后2周ATP水平分别为：术前(456.21±102.06)ng／ml,术后第一周(184.09±42.63)ng／ml；急性排斥出现时(308.81±69.43)ng／m1；治疗后1周(235.35±23.22)ng／ml；治疗后2周(258.36±34.76)ng／ml。急性排斥出现时ATP水升高,但仍低于术前水平,经配对t检验,t=11.21 P<0.0001,其急性排斥出现时的ATP值与术前ATP值的差异有统计学意义；随急性排斥逆转,ATP水平逐渐下降,2周时仍高于术后1周水平,经配对t检验,t=-3.01,P=0.0237(P<0.05),其治疗后2周与术后1周差异有统计学意义。5.18例发生肺部感染受者确诊时CD4+T细胞ATP浓度下降(89.13±8.85)ng／ml,低于术后1周水平(95.84±12.38)ng／ml,经配对t检验,t=6.54,P<0.0001,其差异有统计学意义；明显低于术前水平(381.42±101.32)ng／ml,经配对t检验,t=12.54,P<0.0001,其差异有统计学意义,病情加重时下降更加明显；治疗好转后(治疗后1周)ATP浓度有所回升(92.91±8.97)ng／ml,2周后ATP浓度(96.74±8.60)ng／ml,但仍低于术前水平,经配对t检验,t=12.12,P<0.0001,其差异有统计学意义；采用抗体诱导组与未使用的移植组患者在感染发生后及经治疗随访中的每个检测时期相比,CD4+T细胞ATP水平均较低,经t检验,其差异有统计学意义。[结论]1.应用ATP-CVA法检测肾移植患者术后的细胞免疫功能状态,简便、有效,可以为临床检测预防器官排异反应及预防免疫相关性感染提供新的理论思路。2.ATP-CVA法检测的ATP值在急性排斥反应发生时有上升的趋势,在并发巨细胞病毒性肺炎时有下降的趋势,对急性排斥反应及巨细胞病毒性肺炎的发生可能有一定的预示作用。3.对移植患者应用ATP-CVA法常规监测,有利于快速判定细胞免疫状态,实施个体化免疫治疗。