鸡球虫病是由鸡艾美尔球虫寄生于鸡肠上皮细胞内引起的原虫病,对养禽业造成巨大的经济损失据,估计全世界每年直接和间接经济损失约有10-30多亿美元,中国约30多亿人民币。药物预防是目前防控鸡球虫病的主要措施,随着虫株耐药和立法限制抗球虫药物,人们更加重视免疫预防。虽然商品化活疫苗具有较好免疫保护效果,但是由于活疫苗存在使用不当易爆发球虫感染等安全问题以及较高的生产成本,以亚单位为基础的新型分子疫苗成为研究者们近年研究的热点。具有较好免疫原性的抗原是构建以亚单位为基础的新型分子疫苗的关键。通过研究鸡球虫生活史后发现,位于子孢子和裂殖子前端的微线是构成顶体复合器的重要组成部分,在虫体入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。目前,已证明多种微线蛋白具有良好的免疫原性。艾美耳球虫的顶膜抗原及其微线蛋白家族蛋白是球虫重要的微线蛋白,在球虫入侵宿主细胞、移行以及胞内生存方面发挥重要的作用。但球虫生活史复杂,一种抗原蛋白只在生命周期的部分阶段出现,可能是导致以单一抗原为基础的亚单位疫苗等新型疫苗在抗球虫方面仅具有部分免疫保护力的原因之一。因此,改善抗原的免疫原性可能是一个快速和有效的方法。球虫是胞内寄生原虫,球虫入侵时机体可以诱发细胞免疫等的特异性免疫反应。细胞免疫主要包括CD8+T淋巴细胞(细胞毒性T细胞)和CD4+T淋巴细胞(辅助性T细胞)两种T淋巴细胞。CD4+T细胞和CD8+T细胞在不同种类的球虫感染过程中发挥不同的作用而球虫抗原中的T细胞表位是诱导细胞免疫的关键。为了改善抗原的免疫原性,根据球虫生活周期及其抗原的表达,选取球虫不同阶段表达的不同抗原蛋白,对其进行蛋白氨基酸序列分析,选取有效的抗原表位构建亚单位疫苗是一种改善抗原免疫原性的可行方案。佐剂是一种非特异性免疫增强剂,能够提高抗原的免疫原性及改变免疫应答的类型,延长免疫期增强机体的免疫应答能力。不同佐剂的应用会对机体免疫产生不同的影响,选择合适的佐剂能增强机体产生非特异性或特异性免疫反应,可以提高疫苗免疫的效果,因此佐剂也成为人们增强抗原免疫原性的焦点之一。本研究选取了球虫子孢子与裂殖子等入侵阶段的微线蛋白2(Et MIC2)、微线蛋白3(Et MIC3)和顶膜抗原1(Et AMA1)等几种重要的微线蛋白基因,利用SYFPEITHI和DNAStar等生物学软件对其各自的蛋白氨基酸序列进行分析后,分别选择T细胞表位较为丰富的片段作为亚单位疫苗的候选抗原基因,对基因克隆并线性串联,测序正确后克隆入表达载体,转入大肠杆菌,IPTG诱导表达重组蛋白Et MIC2-Et AMA1-Et MIC3。经SDS-PAGE、Western-blot及IFA鉴定,结果显示重组大肠杆菌成功表达重组蛋白Et MIC2-Et AMA1-Et MIC3。将重组蛋白Et MIC2-Et AMA1-Et MIC3分别与PBS、弗氏佐剂、松花粉多糖、蜂胶佐剂等乳化后制作亚单位疫苗。在雏鸡7和14日龄时颈部皮下多点注射免疫两次,二免后七天除不免疫不感染球虫组(Ⅰ组)外皆接种30,000个新鲜柔嫩艾美耳球虫卵囊。结果显示各蛋白免疫组相对于感染球虫不免疫组(Ⅱ组),体重增长显著,病变积分以及克粪便卵囊数均显著性降低(P<0.05)。而乳化佐剂组(IV,V和VI组)与单独重组蛋白组(III组)比较体重增长升高,病变积分以及克粪便卵囊数有所降低,其ACI结果显示重组蛋白质能够对球虫感染提供良好的免疫保护力,且蜂胶在提高重组蛋白对球虫感染的免疫保护效果方面作用最理想。淋巴细胞增殖效果及其外周血淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例变化结果显示重组蛋白可以有效诱导细胞免疫,佐剂可以增强重组蛋白诱导细胞免疫的效果。在血清特异性抗体及其粘膜免疫抗体s Ig A方面,说明重组蛋白可以引起有效的体液免疫及粘膜抗体,蜂胶佐剂在诱导体液及其粘膜抗体s Ig A方面较其他两种佐剂效果更好。试验结果表明重组蛋白M2-A1-M3能够对抵抗柔嫩艾美耳球虫感染提供抗有效的免疫保护力,而佐剂的应用可以不同程度的提高重组蛋白的免疫保护效果,且蜂胶佐剂相比于松花粉多糖佐剂和弗氏佐剂增强效果更为理想。