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【目的】PI3K-AKT信号通路参与细胞的生长代谢、增殖分化及凋亡等多种生物过程。沉默PTEN基因能够有效的促进神经元轴突再生及脊髓损伤小鼠功能恢复,其可能作用于PI3K-AKT信号通路从而发挥作用。本课题通过采用具有高抑制效率的PTEN特异性抑制剂Bpv(pic),特异性干扰PTEN蛋白的表达,同时分别选用PI3K及mTOR特异性抑制剂阻断PI3K-AKT-mTOR通路,然后观察特异性抑制剂对神经元轴突再生以及凋亡的作用。探讨PTEN蛋白被抑制时,PI3K-AKT-mTOR信号通路在神经元轴突生长和凋亡作用中的关键机制。【方法】1.神经元原代培养:本实验首先对出生后0天(P0)的Wistar新生大鼠脑皮层神经元细胞进行原代分离、培养与纯化后进行体外培养和形态学观察,应用细胞免疫荧光染色以鉴定神经元细胞。2.抑制剂效用:将分离获得的P0 Wistar新生大鼠大脑皮层神经元接种于预先包被的10cm培养皿中,以进行神经元原代培养,并将神经元随机分为四组:(1)对照组;(2)LY294002+bpv(pic)组;(3)Ridaforolimus+bpv(pic)组;(4)bpv(pic)组,应用蛋白印迹(western blotting)技术对培养7天后的神经元细胞PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白表达情况进行观察。3.神经元再生:将分离获得的P0 Wistar新生大鼠大脑皮层神经元接种于预先包被的六孔板中,并将神经元随机分为四组:(1)对照组;(2)LY294002+bpv(pic)组;(3)Ridaforolimus+bpv(pic)组;(4)bpv(pic)组,利用细胞免疫荧光染色的方法对神经元轴突及CSPGs进行染色,并利用Image-Pro Plus 6.0软件测量六孔板中接种于CSPGs基质上神经元轴突长度、数量以及接种于CSPGs基质外神经元轴突穿越CSPGs的百分比,探索特异性抑制剂干扰PTEN蛋白表达后神经元轴突的再生及穿越能力,并研究PI3K-AKT-mTOR信号通路在PTEN蛋白表达调控对神经元细胞产生生理效应中的作用机制。4.神经元凋亡:将分离获得的P0 Wistar新生大鼠大脑皮层神经元接种于预先包被的九十六孔板及培养皿中,并将神经元随机分为四组:(1)对照组;(2)LY294002+bpv(pic)组;(3)Ridaforolimus+bpv(pic)组;(4)bpv(pic)组,建立双氧水细胞凋亡模型,通过Western-blot技术检测细胞凋亡相关蛋白的表达,同时进行细胞Tunel化学染色标记凋亡神经元,计算神经元的存活率,探索干扰PTEN对神经元细胞的抗凋亡能力的影响。【结果】1.实验成功分离纯化P0 Wistar新生鼠大脑皮层神经元细胞,通过形态学观察、β-tubulin III免疫学染色鉴定,证实其具有神经元特性。2.利用PI3K-AKT-m TOR信号通路的特异性抑制剂LY294002与Ridaforolimus,证实m TOR作为PI3K-AKT信号通路的关键分子,参与抑制PTEN后细胞通路作用。3.在CSPGs基质上,bpv(pic)组神经元轴突长度明显长于对照组、LY294002+bpv(pic)组及Ridaforolimus+bpv(pic)组神经元轴突长度,差异具有统计学意义(p<0.001);同时,bpv(pic)组CSPGs基质外神经元轴突穿越CSPGs能力明显强于其他三组,差异具有统计学意义(p<0.001)。4.双氧水细胞凋亡模型基础上,Ridaforolimus+bpv(pic)组及bpv(pic)组神经元细胞存活率明显高于对照组,而LY294002+bpv(pic)组神经元存活率明显降低(p<0.05)。【结论】1.本实验证实抑制PTEN具有显著有效减轻CSPGs的轴突抑制作用;PI3K-AKT-mTOR信号通路在抑制PTEN对神经元细胞轴突增生的调控作用中发挥关键性作用。2.抑制PTEN能够通过PI3K/AKT信号通路,有效增强神经元在脊髓损伤条件下存活能力。3.本课题为抑制PTEN促进中枢神经系统的再生修复提供实验依据,并为进一步研究抑制PTEN治疗中枢神经系统损伤提供理论基础。