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CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repea)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。2012年起第一代CRISPR系统CRISPR/Cas9被改造为基因编辑工具,并衍生出一系列高效、便捷的基因编辑工具,迅速在基础理论、基因诊断和临床治疗等研究领域中得到广泛应用。然而,CRISPR/Cas9也存在编辑效率较低、细胞毒性、脱靶效应等一些亟待解决的问题,在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。与CRISPR/Cas9系统相比,第二代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1只需要一个crRNA并且Cpf1酶的分子量比标准的Cas9要小,Cpf1复合物识别的PAM为5’T-rich序列,剪切位置离识别位点较远并产生粘性末端,让DNA插入更可控。本研究以酿酒酵母为研究对象,探究了提高酿酒酵母中CRISPR系统编辑效率的技术体系,搭建了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统的技术平台,主要研究结果如下:1.探究目的基因表达及表达量对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响。(1)目的基因的表达可提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率。以潮霉素基因(Hyg)为研究对象探究了目的基因在质粒上表达与否对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响:将Hyg基因和两端加终止子的Hyg基因分别连接到表达载体pESC-His上,并分别与构建好的可编辑Hyg基因的pCRCTG418质粒共转化酵母细胞。结果表明,CRISPR系统对质粒上表达的Hyg基因进行了编辑而不表达的Hyg基因没有发生编辑;以酿酒酵母Ado1基因为研究对象探究了目的基因在染色体上表达与否对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响:构建Ado1基因两端加终止子的酵母突变株,将可编辑Ado1基因的pCRCTG418质粒分别转化原始菌株及不表达Ado1的突变株。结果表明,CRISPR系统对染色体上表达的Ado1基因进行了编辑而不表达的Ado1基因没有发生编辑。(2)提高目的基因的表达量可提高CRISPR/Cas9系统编辑效率。以SAM1和SAM2基因为研究对象,分别设计针对目的基因的gRNAs组件,通过DR序列串联到pCRCTG418质粒上,可实现对SAM1和SAM2基因的编辑。通过控制培养基的成分调控SAM1和SAM2基因的表达量,结果表明,SAM1或SAM2基因表达量高于对方则CRISPR/Cas9系统更倾向于对其进行编辑。2.三方激活因子可提高CRISPR/Cas9系统对目的基因的编辑效率。我们将可以特异性提高目的基因表达量的三方激活因子VP64-p65-Rta(VPR)融合到Cas9蛋白的C-末端,分别利用pCRCTG418质粒和pCRCTG418-VPR质粒对酿酒酵母Gal7基因进行编辑,并比较二者的编辑效率,结果表明,CRISPR系统在第4次传代时对Gal7基因进行了编辑,而融合了VPR的CRISPR系统在第2次传代时对Gal7基因进行了编辑,证明了VPR可提高CRISPR/Cas9系统可提高Gal7基因编辑效率,但也需要更多的试验进一步证明三方激活因子的广谱性和适用性。3.建立了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统。将pCRCTG418质粒中的Cas9蛋白替换为Cpf1蛋白并进行密码子优化,原DR序列替换为AATTTCTACTCTTGTAGAT,得到了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统pCRCTG418-Cpf1。分别利用pCRCTG418质粒和pCRCTG418-Cpf1质粒对酿酒酵母ADH7基因进行编辑,并比较二者的编辑效率,结果表明,pCRCTG418-Cpf1质粒适用于酿酒酵母,且其编辑效率与pCRCTG418质粒相当。该系统的建立拓宽了CRISPR系统在酿酒酵母中进行基因编辑的范围。