前言骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能的干细胞。经实验证实体外培养的BMSCs可以在体内、体外向神经细胞、神经胶质细胞分化。BMSCs易于获取并能在体外迅速扩增获得足够数量的细胞,因此被认为是理想的组织工程种子细胞。脱细胞神经细胞外基质材料(AECM)是以SC基底膜管为主、以神经外膜为外套的完整的三维网状支架;它作为有生物活性的神经替代物,具有良好的仿生性,较低的免疫原性。本实验探寻骨髓间充质干细胞的的体外培养、纯化、增殖的技术平台,如何简便容易的获得理想的组织工程种子细胞并初步验证其经抗氧化诱导剂向神经组织细胞分化机制;与AECM在体外条件共培养作为神经组织工程支架材料进行周围神经损伤的可行性。为进一步实验研究和临床应用提供实验依据。材料与方法1、实验动物健康Wistar大鼠15只,体重为100-120克;Wistar大鼠25只,180-200克;雌雄不限。2、骨髓间充质干细胞的体外培养、纯化、鉴定、诱导以及与AECM在体外条件共培养收集用10%FBS低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔的冲洗液,置入培养瓶内培养,24小时后全量换液;待细胞汇合80%时,按1:2传代培养。取三代细胞用CD 44、CD34抗体进行鉴定。用含有1mmol/Lβ-ME、低糖DMEM诱导,诱导后的细胞微量进样器注入到脱细胞神经细胞外基质材料(AECM)内。3、观察指标及检测方法骨髓间充质干细胞细胞形态观察、诱导后免疫细胞化学染色、含有细胞的AECM变色酸2R-亮绿染色、GFAP、NSE免疫组织化学染色。结果1、三代的骨髓间充质干细胞趋于均质纯化,传至九代以后表现出明显的自分化,其在3-7代最适合供做诱导、组子工程种子细胞;β-ME诱导的骨髓间充质干细胞可向神经细胞、神经胶质细胞方向分化。2、AECM与诱导的细胞联合培养细胞在AECM内发生分化,BMSCs与AECM具有良好的细胞亲和性,两者可以复合构建组织工程人工神经。结论1、采用骨髓冲洗液贴壁培养法即可获得纯度很高,形态典型,生物学形态稳定的骨髓间充质干细胞,其在3-7代最适合供做诱导、组子工程种子细胞、以及药物筛选、细胞毒性等实验。2、β-ME做诱导剂可以使骨髓间充质干细胞向神经组织方向分化,诱导的细胞可以表现神经元特异性抗原以及神经胶质细胞抗原。但离诱导成为有功能的、稳定的神经元及胶质细胞尚远,提示骨髓间充质干细胞的分化是多步骤、多因素影响的结果。3、AECM与诱导的细胞联合培养,细胞可表现出周围神经细胞胶质细胞抗原。在体外条件下,AECM可以给细胞提供适宜的微环境并可以使细胞分化。