目的 问号钩端螺旋体(简称钩体)是引起钩体病的重要病原体,人类通过被带菌动物尿液污染的疫水或疫土而感染,趋化和运动系统在钩体感染过程中发挥重要作用。钩体基因组序列分析证明其中有数个趋化调节蛋白CheB和CheR的编码基因,但其具体的调控机制未知。方法1、Real-timePCR检测了钩体基因组中5个基因在钩体感染宿主细胞过程中mRNA的水平变化;2、T-A克隆了 CheB和CheR的编码基因片段并构建了原核表达系统;3、检测了 c-di-GMP浓度变化对CheB和CheR表达菌株表型的影响。结果1、在感染细胞60min后,cheB1的mRNA水平显著提高,cheB3也有一定程度的提高,而cheB2和cheR则无明显差异;2、成功构建了 5个基因的原核表达系统,其中重组CheB1、CheB3和CheR2蛋白使大肠杆菌运动能力明显增强;3、在加入鸟苷酸环化酶抑制剂和磷酸二酯酶抑制剂后,各表达菌株形成菌落大小与对照相比无明显不同,但CheB2菌落形态与对照相比出现明显褶皱。结论CheB和CheR可影响大肠杆菌的swarming运动能力,并受胞内c-di-GMP浓度的影响。目的钩体病是由致病性钩端螺旋体引起的全球流行的人畜共患病,每年有超过50万的病例报告。环二鸟苷信号系统是广泛存在于细菌体内的新型二元信号系统,可以感知外界环境信号并调控细菌运动性、毒力和生物膜形成等多种生理功能。环二鸟苷酸信号分子在胞内的代谢由含有GGDEF结构域的二鸟苷环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二醋酶(phosphodiesterase,PDE)调控。生物信息学分析发现了钩体两个HD-GYP结构域磷酸二酯酶的编码基因LA2383和LA2847,但其具体功能未知。方法 1、通过Real-time PCR检测了钩体基因组中LA2383和LA2847两个基因在钩体感染宿主细胞过程中mRNA水平的变化;2、采用T-A克隆等分子生物学方法构建了L42383和LA2847基因的原核表达系统;3、运用酶标仪及液相色谱仪检测了纯化的重组蛋白对特异性底物bis-pNPP、c-di-GMP、c-di-AMP、cGMP、cAMP及pGpG的磷酸二酯酶活性;4、构建报告质粒检测目的蛋白在大肠杆菌胞内的磷酸二酯酶活性。结果1、在感染宿主细胞12h时,LA2383基因的mRNA水平明显提高,LA2847基因的mRNA水平也有一定程度的提高;2、成功构建了LA2383和LA2847基因的原核表达系统,通过表达、纯化或复性得到单一的目的蛋白;3、LA2383蛋白可以分解特异性底物bis-pNPP,对底物pGpG的酶活性要高于c-di-GMP,而LA2847蛋白对实验所用底物均无法分解;4、LA2383和LA2847基因在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达后,细菌胞内c-di-GMP水平下降。结论LA2383和LA2847基因的mRNA水平在钩体感染细胞的过程中具有先降后升的趋势,在感染后12h达到峰值;HD-GYP结构域蛋白LA2383具有磷酸二酯酶活性,可以降解c-di-GMP和pGpG;过表达LA2383和LA2847蛋白使大肠杆菌胞内c-di-GMP水平下降;因此,推测HD-GYP结构域蛋白在钩体感染过程中发挥重要作用。