水牛体细胞克隆是良种水牛快速扩繁的一种有效技术手段,但因其效率较低,尚无法推广应用。研究表明,来自不同水牛个体细胞的克隆效率存在明显差异,但导致这种差异的机理尚不清楚。体细胞的克隆效率主要取决于其重编程的效率,而重编程的效率可能与细胞的染色质开放度和重塑难易程度密切相关。为此,本研究拟通过比较不同克隆效率细胞系的染色质重塑相关基因表达、染色质开放程度和转录水平的差异,并探讨ATP含量对染色质重塑相关基因表达的影响,以便初步探明不同个体水牛体细胞克隆效率差异的机制,为提高水牛体细胞克隆效率奠定基础。研究取得如下结果:1.不同克隆效率的水牛体细胞特征分析选择本实验室建立的克隆效率存在明显差异的2个水牛胎儿体细胞系(克隆效率较高的BFF3和克隆效率较低的BFF1),分析它们之间的染色质重塑SWI/SNF ATP依赖性的核心酶基因SMARCA4表达差异。结果发现,BFF1中SMARCA4表达水平显著低于BFF3(P<0.05)。两株细胞的生长特征检测发现,在对数期的增殖速度并无明显差异,平台期后的BFF1细胞增殖速度低于BFF3;接触抑制后,两株细胞G0/G1期所占比例分别为90.75%、91.18%。在 G0/G1 期,BFF3 染色质重塑 SWI/SNF 家族 SMARCC1、SMARCC2和SMARCE1基因的表达水平显著高于BFF1(P<0.05),SMARCA4、SMARCA2、SMARCAL1 和SMARCB1基因的表达水平差异不显著。2.不同克隆效率的水牛供体细胞染色质开放度与转录水平的分析为了解克隆效率与供体细胞染色质开放程度及转录水平的关系,对BFF1、BFF3细胞进行ATAC-seq及RNA-seq分析。ATAC-seq结果表明:在全基因组水平上,与BFF1细胞相比,BFF3细胞染色质、SMARCA4、SMARCA2及RNA结合蛋白-mRNA加工因子的开放程度更高,KEGG功能富集显示BFF3细胞在催产素信号通路及调节干细胞的多能性通路上具有特异性。RNA-seq表明,与BFF1细胞相比,BFF3细胞中ATP1B1、ATP11A的转录水平更高,差异极显著(P<0.01)。3.ATP含量对SWI/SNF家族相关基因表达的影响采用线粒体复合物I的功能抑制剂鱼藤酮(0.5 μM)处理BFF1、BFF3细胞24 h后,细胞凋亡率分别为10.16%、20.85%,细胞增殖受阻,线粒体膜电位下降,ATP含量减少;与未处理组相比,SMARCA4、SMARCA2、SMARCAL1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCB1、SMARCE1基因的表达均降低,BFF1细胞下降幅度较大;采用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(5 mM)处理细胞12 h后,两株细胞ATP水平均升高;与未处理组相比,BFF1细胞中 SMARCA4、SMARCA2、SMARCAL1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCB1、SMARCE1基因的表达降低,除SMARCE1外其余的基因的表达均显著下降(P<0.05);BFF3细胞中除SMARCA2表达降低外其余基因的表达升高,其中SMARCA4及SMARCAL1差异极显著(P<0.001)。上述结果表明:克隆效率不同的水牛体细胞在染色质开放程度、染色质重塑相关基因、ATP功能基因的转录水平以及ATP含量对染色质重塑基因的影响方面存在差异;克隆效率较高的细胞对ATP的依赖较大,染色质重塑基因的表达更高。