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背景宫颈癌（cervical carcinoma）是常见的妇科恶性肿瘤之一,全世界每年约有30万女性死于宫颈癌。从宫颈上皮内瘤变到宫颈浸润癌约1020年,是早期防治宫颈癌的重要阶段。目前,宫颈癌的筛查方法很多,但均存在诸多缺陷。探索灵敏度高、特异性强的宫颈癌检测和诊断方法（如价格低廉、检测方便的荧光探针等）成为研究的热点。基质金属蛋白酶-2（matrix-metalloproteinase,MMP-2）在正常宫颈上皮细胞中不表达或低表达,而在宫颈上皮内瘤变和宫颈浸润癌中高表达,可用于宫颈良、恶性病变的鉴别诊断,也为探索以MMP-2为靶点的宫颈癌检测方法奠定了基础。现有的检测MMP-2的方法均无法在活细胞或活体中进行检测。以MMP-2为靶点制备的Cd Te量子点探针由于毒性较大等原因而在实际应用中受到限制。目的本研究将荧光基团[7-（二乙胺基）香豆素-3-羧酸]通过能被MMP-2切割的多肽链（GPLGVRGKGG）连接到荧光淬灭基团{4-[4-（二甲基氨基）苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯},构建以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针。研究其用于检测宫颈癌细胞和宫颈癌荷瘤小鼠活体成像的可行性,为其用于宫颈癌的检测提供科学依据。方法1.制备荧光基团香豆酸琥珀酰亚胺活性酯。2.通过能被MMP-2切割的多肽链（GPLGVRGKGG）将荧光基团[7-（二乙胺基）香豆素-3-羧酸]连接到{4-[4-（二甲基氨基）苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯},制备以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针。3.测试MMP-2、MMP-1和其他生物学相关物质对探针的荧光响应。4.培养宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞,应用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）,实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,q PCR）及Western blotting方法检测MMP-2 m RNA和蛋白在4种不同宫颈癌细胞系中表达情况。5.将以MMP-2为靶点的荧光探针与宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞共孵育,通过共聚焦荧光显微镜观察探针对不同宫颈癌细胞的识别能力。6.构建宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠模型;以宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠为研究对象,分别通过尾静脉和瘤内注射将以MMP-2为靶点的荧光探针注射到小鼠体内,通过活体成像仪观察活体成像情况。结果1.制备了香豆酸琥珀酰亚胺活性酯,并通过核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,1H NMR）、核磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance spectrum,13C NMR)和电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）表征。香豆酸琥珀酰亚胺活性酯的紫外-可见光谱最大吸收峰为445 nm。香豆酸琥珀酰亚胺活性酯为强烈的绿色荧光,荧光发射峰在480 nm处。为探针的合成奠定了基础。2.构建了以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针并通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF）和高效液相色谱法（high-pressure liquid chromatography,HPLC）表征。3.荧光响应实验结果显示:（1）随着时间的增加,以MMP-2为靶点的荧光探针在480 nm的荧光强度明显增强,增强了10倍左右并在2 h趋于平衡。（2）相关的生物学物质如MMP-1、K+、Mg2+、Na+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、L-色氨酸（L-tryptophan,L-Trp）、L-丝氨酸（L-serine,L-Ser）、L-天冬氨酸（L-aspartic acid,L-Asp）、HCO3-、NO3-、ClO4-、F-和Br-对以MMP-2为靶点的荧光探针的荧光光谱没有显著的变化,荧光响应不明显。4.RT-PCR、qPCR、Western blotting结果均显示:MMP-2在4种宫颈癌细胞中的表达顺序是:CaSki细胞>SiHa细胞>C33-A细胞>HeLa细胞（P<0.05）。5.细胞成像结果显示:用以MMP-2为靶点的荧光探针对宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞进行荧光识别,当以MMP-2为靶点的荧光探针和宫颈癌细胞孵育2 h之后,宫颈癌细胞都表现出绿色荧光且其荧光强度为CaSki细胞>SiHa细胞>C33-A细胞>HeLa细胞。6.构建宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠模型。活体成像结果显示,分别将以MMP-2为靶点的荧光探针（1mM）通过尾静脉和瘤内注射到小鼠体内后,两种荷瘤小鼠的瘤体均呈现强烈的荧光,但宫颈癌SiHa细胞荷瘤小鼠瘤体的荧光强度大于宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠瘤体的荧光强度。结论1.制备了基于香豆素荧光基团的靶向MMP-2荧光共振能量转移探针。2.该探针可用于宫颈癌活细胞成像和宫颈癌荷瘤小鼠体内成像。