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目的:探讨TOX3表达水平与乳腺癌发展及临床病理的关系;通过调节乳腺癌细胞内TOX3基因的表达,以研究TOX3在乳腺癌细胞凋亡方面的作用及对线粒体凋亡途径的影响;初步阐明DP对乳腺癌细胞凋亡的作用及对TOX3基因和线粒体凋亡信号通路的影响;进一步研究TOX3基因在DP诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用。方法:应用免疫组化法检测乳腺癌组织和正常乳腺组织中TOX3蛋白的表达;采用RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞系内源性TOX3基因的表达,构建稳定干扰TOX3基因的乳腺癌细胞系;应用慢病毒表达载体构建稳定过表达TOX3基因的乳腺癌细胞系;采用MTT和平板克隆实验检测各组细胞增殖活性及单克隆形成率;流式细胞术检测各组细胞早、晚期凋亡及细胞各周期的变化;应用透射电镜观察各组细胞凋亡形态学变化;实时荧光定量PCR和Western blot检测乳腺癌组织和细胞内相应基因mRNA及蛋白的表达。结果:1、乳腺癌组织中TOX3的表达明显高于正常乳腺组织,T3和T4期及有淋巴结转移的肿瘤组织TOX3的表达显著升高。2、TOX3在ZR-75-1细胞中相对高表达,而在MDA-MB-231细胞相对低表达。3、经测序鉴定,构建的TOX3干扰重组质粒和过表达重组质粒序列正确,成功构建稳定转染 TOX3 的 ZR-75-1 细胞株 TOX3-shRNA和MDA-MB-23 1-TOX3细胞株;实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示 TOX3-shRNA-3 细胞的干扰效率最高,过表达细胞株MDA-MB-231-TOX3内 TOX3表达水平明显上调(P<0.05)。4、TOX3基因沉默后细胞的增殖活性明显下降,单克隆形成数目明显减少,G0/G1期细胞比例增多(P<0.05),细胞的凋亡率增加,并出现典型凋亡形态学特征。过表达TOX3基因后细胞增殖活性增强,单克隆形成数目增加,G2/M期细胞所占比例明显增多(P<0.05)。与阴性对照组比较,血清分别饥饿24h和48h后,TOX3过表达组细胞生长抑制率降低;血清饥饿48h后,TOX3过表达组细胞早、晚期凋亡率下降(P<0.05)。5、与对照组比较,TOX3干扰组TOX3及Bcl-2的mRNA和蛋白水平显著下调,而Bax、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达明显上调(P<0.05),Bax、Cyt-c,Cleaved-caspase9 和 Cleaved-caspase3 的蛋白表达均明显上调(P<0.05)。TOX3过表达组内TOX3、Bcl-2 mRNA和蛋白含量显著上调,Caspase-3活性蛋白及其mRNA水平明显降低(P<0.05),而Bax mRNA和蛋白表达无明显变化(P>0.05)。6、DP可抑制ZR-75-1细胞的增殖活性,并呈一定的时间-剂量依赖性。与空白对照组比较,经DP处理后各组细胞G0/G1期细胞所占比例明显增多,早、晚期凋亡率明显增加(P<0.05),电镜下可见典型凋亡形态学特征。7、与空白对照组比较,DP处理组TOX3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.05),而Bax和Caspase-3 mRNA及其活性蛋白表达显著上调(P<0.05)8、与TOX3干扰组或DP组比较,TOX3干扰与DP共同处理组的细胞增殖活性明显下降,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),TOX3相 Bcl-2的表达进一步降低(P<0.05),而Bax和Caspase-3表达进一步上调(P<0.05)结论1、TOX3在乳腺癌组织中高表达,且与临床分级和淋巴结转移相关。2、成功建立了稳定干扰TOX3基因的乳腺癌细胞株TOX3-shRN A和稳定过表达TOX3基因的乳腺癌细胞株MDA-MB-23 1-TOX3。3、TOX3基因沉默可抑制ZR-75-1细胞增殖并诱导其凋亡,过表达TOX3基因可促进MDA-MB-23 1细胞增殖并对其具有一定的保护作用,其机制主要是通过线粒体途径发挥作用。4、DP可抑制ZR-75-1细胞增殖并诱导其凋亡,TOX3基因沉默可增强DP诱导的ZR-75-1细胞凋亡,二者的作用机制均与TOX3参与的线粒体凋亡途径相关。