论文部分内容阅读
目的:筛选ZNF185抗原表位;合成携带ZNF185抗原表位的四种多肽抗原,并进一步研究相应合成多肽诱导的免疫应答和免疫避孕效果。方法:(1)通过采用DNA Star软件来预测ZNF185蛋白二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性与抗原指数等,并确定ZNF185抗原表位,制备并纯化四种多肽,最终合成携带ZNF185抗原表位的四种多肽抗原;(2)选用7-8周龄雄性小鼠,小鼠免疫的分组按照以下三个要素进行:抗原(抗原肽-Ⅰ、抗原肽-Ⅱ、抗原肽-Ⅲ或抗原肽-Ⅳ),免疫剂量(80μg),免疫途径皮下注射(Hypodermic injection,Hypo),以及阴性对照组(注射PBS);(3)小鼠注射免疫后,定期尾静脉取血,析出血清,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来进行抗体滴度检测;(4)再次通过ELISA实验,对筛选出来的抗原肽进行最适浓度的筛选;(5)制作睾丸及附睾组织石蜡切片,通过苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)来观察小鼠睾丸及附睾结构的变化;(6)小鼠注射免疫后,当抗体滴度达到峰值或抗体滴度恢复到正常水平时,对免疫小鼠1:2(雄性:雌性)进行合笼,研究免疫避孕效应及生育恢复力的情况;(7)小鼠免疫注射后,检测睾丸、附睾系数,精子密度、活力、活率以及畸形率等精子质量的相关指标;(8)每组实验均在相同条件下重复3次,采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,Graphpad-prism 6.04软件进行作图分析。结果:(1)成功筛选并合成携带ZNF185基因抗原表位多肽,采用全化学合成方法获得的融合多肽ZNF185纯度均大于95%;(2)ELISA结果显示:抗原肽-Ⅲ免疫组的抗体滴度显著高于其他抗原肽组,且随免疫周数的增加而逐渐上升,于免疫后第12周达到高峰(P>0.05),峰值为1:4000,初步成功筛选出能产生高抗体滴度的抗原肽-Ⅲ;(3)对筛选出的抗原肽-Ⅲ再次进行最适浓度检测,ELISA结果显示:抗原肽-Ⅲ免疫实验组的抗体滴度显著高于对照组(P<0.05);(4)HE染色结果显示:各免疫实验组睾丸及附睾组织结构较阴性对照组无明显差异(P>0.05);各免疫实验组附睾管内精子密度均有明显减少(P<0.05);(5)小鼠注射免疫后,合笼实验结果显示:免疫后第17周,抗原肽-Ⅲ免疫组的交配率和妊娠率显著低于对照组(P<0.05),表明抗原肽-Ⅲ更具有免疫避孕效果,其每窝产仔数差异不显著(P>0.05);当抗体滴度恢复到正常程度时,免疫实验组的交配率和妊娠率均有一定的回升;(6)小鼠附睾精子计数及活力与活率统计结果显示:与阴性对照组相比,抗原肽-Ⅲ免疫实验组的精子数、精子活力及活率均有明显降低(P<0.05),这与免疫后小鼠避孕效果相一致;(7)抗原肽-Ⅲ实验组小鼠附睾精子畸形较PBS阴性对照组相比差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论:ZNF185避孕疫苗具有一定的抗生育能力。