壁虎为壁虎科动物无蹼壁虎(Gekko swinhonis Guenther.)、多疣壁虎(Gekko japonicus Dumeril.et Bibron.)或蹼趾壁虎(Gekko subpalmatus Guenther.)的干燥全体,又名守宫、天龙等。气味咸、寒,有小毒。壁虎炮制历史悠久,其在历代本草中的炮制方法包括净制、切制、炒制、焙制、酒炙等。现代研究认为壁虎是一味非常重要的抗癌动物药,随着科学技术的发展,壁虎的药用价值被不断的开发利用,并且被用来治疗多种疾病。壁虎并未收载入我国历代药典,2020年版药典亦未见收录,部分省市级炮制规范中规定了炮制方法,但仅为炮制术语的描述,缺少具体的炮制工艺参数和量化指标,导致壁虎炮制品质量不稳定,临床用药不安全。因此本文利用现代分析仪器和多元统计方法结合的手段,对壁虎炮制工艺进行研究,优选出壁虎的烘制最佳工艺,并且制定壁虎的质量评价标准,探究烘制前后的物质基础变化,以期为壁虎的临床合理药用提供参考。研究目的优选壁虎蛋白质、多糖的最佳提取工艺,优选壁虎的最佳烘制工艺并且探讨壁虎烘制过程中影响较大的指标。对壁虎烘制前后HPLC指纹图谱和紫外指纹图谱进行研究,建立壁虎烘制品的指纹图谱。探究烘制前后检测指标的变化趋势,制订烘制壁虎的质量评价草案。探讨壁虎烘制前后的抗肿瘤作用。研究方法1.蛋白质提取工艺的优化研究。在单因素提取试验的基础上,以pH、提取温度、提取时间和料液比为自变量,蛋白质提取含量为指标,通过Box-Behnken响应曲面法优化中药壁虎中水溶性蛋白的超声提取工艺。2.多糖提取工艺的优化研究。在单因素提取试验的基础上,以醇沉浓度、醇沉时间、提取时间和料液比为自变量,多糖提取含量为指标,通过Box-Behnken响应曲面法优化中药壁虎中多糖的超声提取工艺。3.多指标主成分分析法对壁虎烘制工艺的优化研究。采用L9(34)正交试验法,对壁虎烘制温度、铺药厚度、烘制时间三个因素进行研究,以外观指标(硬度,粘附性,咀嚼性,色差值)、常规检查项目(水分含量,水溶性浸出物)、物质基础(蛋白质含量,多糖含量,粗脂含量)为评价指标,采用主成分分析方法计算综合得分,优选出壁虎烘制的最佳工艺,分析对烘制影响较大的指标。4.壁虎烘制品指纹图谱的建立。采用高效液相色谱法建立10批壁虎生品和烘制品的指纹图谱,进行聚类分析,比较烘制前后壁虎样品的差异。并且通过紫外指纹图谱对壁虎生品与烘制品进行分类识别。5.壁虎烘制前后指标性成分的比较研究。对10批壁虎生品和烘制品的水分含量、水溶性浸出物含量、灰分含量、蛋白质含量、多糖含量、粗脂含量、色差值进行测定,运用数理统计方法进行差异的比较,并对壁虎烘制品进行质量评价。6.研究壁虎烘制前后的抗肿瘤作用。采用MTT法对比烘制前后壁虎中蛋白质与多糖对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用。研究结果1.利用单因素考察与响应曲面法结合的方式对壁虎水溶性蛋白的提取工艺进行优化研究,结果得到的提取工艺为料液比1:70,提取时间84min,pH 14,此工艺条件下壁虎水溶性蛋白质含量为272.92mg·g-1。验证结果表明响应曲面方法得到的回归模型与实际情况拟合良好,可以很好预测壁虎蛋白质含量。2.利用单因素考察与响应曲面法结合的方式对壁虎多糖的提取工艺进行优化研究,结果得到的提取工艺为料液比1:60,提取时间80min,醇沉浓度为80%,此工艺条件下壁虎水溶性多糖含量为1.4305 mg·g-1。验证结果表明响应曲面方法得到的回归模型与实际情况拟合良好,可以很好预测壁虎多糖含量。3.利用正交试验方法对壁虎烘制工艺进行优化,采用主成分分析方法对11个指标性成分进行研究,最终提取出4个主成分因子,计算主成分综合得分,结果得出壁虎的最佳烘制工艺为温度100℃,时间70 min,铺药厚度3 cm,三个因素对壁虎烘制工艺影响的主次顺序为烘制温度>烘制时间>烘制厚度,对壁虎烘制工艺影响较大的指标为色泽、水溶性蛋白质、粗脂含量和质地。4.建立了壁虎生品与烘制品的指纹图谱,对不同来源壁虎进行分类分析,结果表明生品相似度在0.643～0.969之间,烘制品相似度在0.614～0.976,烘制后壁虎的质量并没有趋于一致。对高效液相指纹图谱数据进行聚类分析,发现壁虎样品烘制前后仍然被聚为一类。对紫外指纹图谱得到的数据进行二阶求导处理,采用主成分分析和偏最小二乘判别分析方法对数据进行分析,发现可以明显将壁虎生品与烘制品区分。5.对壁虎烘制品进行质量评价,水分:烘制后平均值为1.5249%,上浮20%,暂拟定烘制壁虎水分含量不得超过2%;水溶性浸出物:烘制后平均值为6.4094%,下浮20%,暂拟定烘制壁虎水溶性浸出物含量不少于5%;灰分:烘制后平均值为15.3930%,上浮20%,暂拟定烘制壁虎灰分含量不得超过18%;粗脂:烘制后平均值为20.4752%,上浮20%,暂拟定烘制壁虎粗脂含量不得超过25%;蛋白质含量:烘制后平均值为150.7688 mg·g-1,下浮20%,暂拟定烘制壁虎蛋白质含量不少于120mg·g-1;多糖含量:烘制后平均值为2.1570 mg·g-1,下浮20%,暂拟定烘制壁虎多糖含量不少于1.7 mg·g-1。6.壁虎生品与烘制品中蛋白质和多糖均可以抑制癌细胞的增殖,但烘制前后抑瘤率无显著性差异。研究结论及意义优化得到的壁虎蛋白质提取工艺准确可靠,且具有一定的可操作性和实用价值。优化得到的壁虎多糖提取工艺准确可靠,可以进行多糖含量的测定。对多项评价指标进行主成分分析,优选的壁虎最优烘制工艺科学可用。高效液相紫外检测在单一波长处建立的指纹图谱无法识别生品与烘制品,但通过紫外指纹图谱全波长分析可以进行识别,说明烘制使壁虎内在质量发生变化,但在特定单一波长处无法将其鉴别,该方法为鉴别壁虎生品和烘制品提供了依据。通过对烘制前后多指标成分数据的分析,制订出壁虎烘制品的评价草案。虽然烘制前后的壁虎抗肿瘤活性没有显著性差异,但烘制壁虎具有质地酥脆,腥味降低,易于吞服的优点。综上所述,本实验利用现代科学分析仪器与多元数理统计方法,对烘制壁虎进行系统研究,将壁虎的传统炮制术语通过实验室方法转化为炮制工艺参数,并且制订了烘制品的质量评价指标,以期为壁虎的炮制方法与现代应用提供参考。