细叶百合放氧复合体LpPsbP抗盐碱机制研究

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放氧复合体蛋白(Photosystem II亚基P,Psb P)是光合系统П的析氧复合物(OEC)的组成部分,属于Psb P蛋白家族。Psb P在维持体内活性锰簇中起重要作用,对于维持体内PSII活性至关重要。在细叶百合鳞茎中克隆出对盐胁迫有反应的LpPsbP基因,初步分析表明,LpPsbP参与调控细叶百合对盐逆境的应答。深入研究了LpPsbP调控植物抗盐碱应答的分子机制,主要取得研究结果如下:1.从细叶百合中克隆出LpPsbP基因,进行生物信息学分析:细叶百合与其他植物的Psb P具有较高的同源性以及相似的保守区,细叶百合LpPsbP蛋白与沉水樟、杜鹃等植物的Psb P的亲缘关系较近,LpPsbP蛋白存在许多螺旋和卷曲结构,属于Dcr B超家族。实时定量PCR结果显示,在不同盐胁迫下LpPsbP基因表达量均表现为上升。LpPsbP基因的表达量在H?O?胁迫48 h后达到峰值,为对照组的3.05倍;在Na Cl处理36 h后达到峰值,为对照组的3.93倍;Na HCO?胁迫12 h表达量达到峰值,为对照组的4.38倍;Na2CO?胁迫处理48 h后达到峰值,为对照组的4.33倍。2.构建pGEX-LpPsbP蛋白表达载体,成功诱导出LpPsbP蛋白。不同诱导条件筛选,结果显示1M IPTG诱导1h时蛋白表达量达到最大。pGEX-LpPsbP蛋白大量诱导,低温超声裂解后得上清和沉淀,经电泳后确定重组蛋白位于沉淀中,以包涵体形式存在,通过包涵体裂解和蛋白纯化实验得pGEX-LpPsbP纯化蛋白,可用于后续实验研究。3.构建pBI121-LpPsbP植物过表达载体,经农杆菌介导的转基因技术,分别将pBI121-LpPsbP转入烟草和细叶百合。观察H2O2、Na Cl、Na2CO3、Na HCO3四种盐胁迫处理下,转基因烟草中种子萌发、幼苗生长、成苗表型和气孔开放,测量净光合速率、蒸腾速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度,叶绿素含量,O2-含量,H2O2含量和丙二醛含量,进行NBT和DAB染色分析,结果表明LpPsbP过表达植株在不同盐胁迫下的耐受性均好于野生型。4.构建pGBKT7-LpPsbP表达载体,经毒性检测验证pGBKT7-LpPsbP不会自激活。经pGBKT7-LpPsbP与百合cDNA文库融合,筛选出18个互作片段,初步证明2、5号蛋白与pGBKT7-LpPsbP互作。选取2号Lp Fox O基因,进一步构建出pGADT7-Lp Fox O表达载体。利用酵母双杂初步验证了LpPsbP与Lp Fox O两个蛋白的互作关系。结果表明,转基因植株与野生型相比具有更好的盐胁迫耐受性。
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