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第一部分 表达CTLA-4抗体的重组流感病毒构建及筛选背景:原发性肝癌（HCC）是全世界范围内的恶性肿瘤之一,世界范围内死亡率居第三位,而在亚洲其死亡率居第二位。尽管科学家们不断探索研究治疗肿瘤的方法,但由于肿瘤细胞增长迅速,易侵袭周围组织等,就目前为止其治愈率并未显著的提高。因此,寻找新的治疗肝癌的方法一直是人类面临的挑战。越来越多的研究表明,溶瘤病毒可选择性地靶向性癌细胞而对正常细胞无明显影响,细胞毒性T淋巴细胞相关抗-4（CTLA-4）可靶向T细胞中的调节途径,增强抗肿瘤免疫应答,因此,研究表达CTLA-4抗体的溶瘤病毒对癌症治疗方面有重要作用。目的:拯救表达免疫检查点muCTLA-4抗体的重组流感病毒,并对其进行全面鉴定。方法:（1）在A/Puerto Rico/8/34（PR8）流感病毒的PB1上构建muCTLA-4的抗体重链、PA上构建muCTLA-4的抗体轻链,与流感病毒PR8的6个质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS-1、MDCK细胞,收集细胞上清,将其接种于SPF鸡胚、超滤浓缩、纯化等步骤获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu-muCTLA-4;（2）通过电镜观察重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的形态与大小分布、血凝试验、EID50、PCR等方法对rFlu-muCTLA-4进行全面鉴定;（3）重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4经纯化、浓缩、离子交换后,利用ELISA实验测定rFlu-muCTLA-4中anti-CTLA-4抗体的含量。结果:（1）经透射电镜观察rFlu-muCTLA-4多数为球形,表面有棘突,其颗粒直径约在80120nm之间,表明重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的病毒形态和颗粒大小分布符合流感病毒典型特征;（2）收取阳性尿囊液,经血凝检测为阳性,rFlu-muCTLA-4的血凝效价为2910;rFlu-muCTLA-4的EID50为10-8 EID50/mL、重组溶瘤病毒rFlu-muCTLA-4的PB1、PA基因片段与预期大小一致。（3）分别收取接种重组病毒rFlu-muCTLA-4第2、3、4天的鸡胚,经蛋白纯化,可检测到anti-CTLA-4抗体。结论:本实验成功构建了一株表达免疫检查点抑制剂muCTLA-4抗体的重组流感病毒,并完成对该病毒的初步鉴定,为下一步的体内、外实验提供一定的基础依据。第二部分 表达CTLA-4抗体的重组流感病毒治疗H22肝癌细胞的体内、外实验研究目的:评价构建的重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对小鼠H22肝癌的治疗效果。方法:（1）体外实验,采用MTS方法检测溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对H22细胞株的杀伤作用,并检测r Flu-mu CTLA-4对H22细胞的毒性;（2）体内实验:通过建立Balb/c小鼠肝癌H22细胞皮下种植模型,观察并评价溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对肿瘤的抑制和延长生存情况。（3）小鼠治疗后,眼球取血,收集血清,通过血凝抑制实验（HI）检测小鼠产生的保护性抗体情况。结果:MTS检测结果显示,1.0 MOI的重组病毒P=0.0307（P<0.05）、2.0 MOI的重组病毒P=0.0017（P<0.01）,5.0 MOI的重组病毒P=0.0011（P<0.01）,2.0 MOI、5.0 MOI的病毒相比1.0 MOI组H22细胞活力显著降低,呈现剂量依赖性,表明r Flu-mu CTLA-4能特异性杀伤H22细胞（P<0.05）。在小鼠模型中能显著抑制肿瘤体积,并延长小鼠的生存期。在血凝抑制实验检测到了较高的血凝抑制抗体效价,实验结果表明重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4可以诱导小鼠产生保护性的抗体。结论:重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4在体内、外能靶向杀伤肝癌细胞,并能够抑制小鼠肿瘤体积的增长,延长小鼠的生存期,并且给予病毒治疗后小鼠的体内可以产生较高的保护性抗体,此研究有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的思路。