目的:构建含有RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的原核表达载体，经诱导表达和纯化获得融合蛋白，并初步分析融合蛋白对乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性结合、细胞迁移和侵袭的影响。同时构建含有RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的重组bacmid，转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒，为后续的功能研究奠定基础。　　 方法:　　 1.原核表达载体 pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP的构建与鉴定。PCR分别获得EGFP、RGD-IFN-α2a-Core和RGD-IFN-α2a(300)-Core编码序列，将EGFP序列克隆到pGEX-4T-1载体上，获得pGEX-4T-1-EGFP质粒，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切该质粒，并与经过同样双酶切的RGD-IFN-α2a-Core以及RGD-IFN-α2a(300)-Core的片段连接，得到 pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP重组质粒，进行酶切鉴定。　　 2.原核表达载体诱导条件的优化及目的蛋白的纯化和鉴定。使用重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导目的蛋白表达;并对IPTG的诱导浓度、诱导温度进行优化，通过亲和层析分离纯化融合蛋白，并通过SDS-PAGE和western blot对其进行鉴定。　　 3.RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的生物学功能。通过原核表达并纯化RGD、HCV Core与IFN-α2a不同片段的融合蛋白，分析融合蛋白对乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性结合、细胞迁移和侵袭的影响，初步鉴定不同融合片段对肿瘤细胞的生物学作用。　　 4.重组转移载体 pFastBacDual-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pFastBacDual-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP的构建。使用EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切质粒pET28a-RGD-IFN-α2a-Core和pET28a-RGD-IFN-α2a(300)-Core，回收片段RGD-IFN-α2a-Core和RGD-IFN-α2a(300)-Core插入到pFastBacDual-EGFP上，分别获得重组质粒 pFastBacDual-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pFastBacDual-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP。　　 5.重组的bacmid的获得。使用重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞，获得重组bacmid，并使用M13引物通过PCR对重组bacmid进行鉴定。　　 6.重组杆状病毒的获得、扩增及鉴定。使用重组bacmid转染Sf9细胞，获得P1代重组杆状病毒。用P1代重组杆状病毒感染St9细胞，经免疫荧光和westernblot检测融合蛋白在细胞中的表达。　　 结果:　　 1.重组原核表达质粒pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pGEX-4T-1-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，电泳显示分别在1.1kb和940bp处出现目的条带，表明重组原核表达质粒构建成功。　　 2.重组原核表达质粒经IPTG诱导表达的蛋白通过SDS-PAGE分析，结果分别在大约93kDa和86kDa处出现目的条带。　　 3.优化重组融合蛋白诱导表达条件，结果表明在18℃，用0.1mmol/L IPTG诱导16h，能获得可溶性融合蛋白。　　 4.重组原核表达质粒诱导表达蛋白的纯化及western blot鉴定，结果显示经亲和层析获得目的蛋白，western blot检测表明目的蛋白能与特异性抗体相结合。　　 5.RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的生物学功能。在体外实验中，纯化的融合蛋白能与乳腺癌细胞MDA-MB-231特异性结合，与GST-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP相比， GST-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP对MDA-MB-231细胞的结合能力更强，而且二者对MDA-MB-231的结合能力都随蛋白浓度的提高而增强，在蛋白浓度为10μmol/L时结合能力最强。在细胞迁移和侵袭实验中，二者都能显著抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭。　　 6.重组转移载体 pFastBacDual-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和pFastBacDual-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP，经EcoRⅠ和HinⅢ双酶切后，电泳显示分别在大约1.1kb和940bp出现目的条带，表明重组转移载体构建成功。　　 7.重组bacmid使用M13引物经PCR扩增后，分别在大约4.45kb和4.24kb处出现特异性条带，表明重组bacmid构建成功。　　 8.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h后，间接免疫荧光检测显示在细胞表面出现特异性红色荧光，表明融合蛋白在细胞中得到表达。　　 9.重组的杆状病毒感染Sf9细胞72h后，用小鼠抗HCV Core抗体作为一抗，western blot检测显示，vAC-RGD-IFN-α2a-Core-EGFP和vAC-RGD-IFN-α2a(300)-Core-EGFP感染后的细胞分别在约42kDa和33kDa处出现特异性条带，表明融合蛋白在细胞中得到成功表达。　　 结论:构建了含有RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，通过亲和层析分离纯化，获得纯度较高的融合蛋白。纯化后的融合蛋白能与肿瘤细胞MDA-MB-231特异性结合并抑制其迁移和侵袭。同时构建了含有RGD、HCV Core与IFN-α2a不同融合片段的重组杆状病毒，间接免疫荧光和western blot都证实融合蛋白在细胞中得到了表达。这为研究RGD、HCVCore和不同长度IFN-α2a片段的融合蛋白形成类病毒颗粒的机制，及其用于肿瘤靶向治疗的可行性奠定了基础。