随着围生医学的发展，机械通气技术不断完善以及肺表面活性物质的应用，早产儿尤其是极低出生体重儿的存活率不断提高，但同时也伴随慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD）发病率的逐年上升。CLD严重影响早产儿的生活质量，是新生儿致残的主要疾病之一，虽然近年的研究对CLD病理特征有了深一步的认识——以往认为是严重的气道损伤、肺泡过度充气和肺纤维化，目前认为其病理特征主要是肺泡变大且结构简单化、肺泡数目减少、毛细血管结构异常等发育不良的表现。但CLD发病机制目前仍然未完全阐明，因而缺乏有效治疗措施，是目前新生儿疾病研究的热点和难点。CLD的发生可能是多种因素引起的未成熟肺的反应性损伤，其中吸入高浓度氧气（高氧）是引起早产儿CLD损伤的主要原因之一。目前研究已经肯定高氧引起肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）凋亡的始动因子是活性氧簇ROS，而AECⅡ的增殖、移行及向肺泡Ⅰ型上皮细胞（AECⅠ）转化在高氧肺损伤修护过程中起着关键作用。而且AECⅡ凋亡及增殖异常可能是高浓度氧在肺发育关键阶段引起肺的生长和重塑异常的重要因素。因而，我们推测采取一定措施防止高氧肺损伤时AECⅡ的凋亡，增加AECⅡ增殖、移行及向AECⅠ转化诱导肺血管发生可能有助于防治早产儿CLD。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种多功能细胞因子。研究发现HGF能促进肺发育；促进肺损伤后肺上皮细胞增殖修复；预防或治疗肺纤维化；诱导肺血管发生；抑制缺血—再灌注诱导的肺内皮细胞凋亡，有助于肺损伤后修复。本课题以新生鼠及早产鼠为研究对象，更接近临床实际，并同时进行了在体及离体水平的研究，从以下几方面阐明HGF对高氧致早产儿CLD保护作用及机制。第一部分持续高氧暴露对新生大鼠肺组织病理、氧化、细胞凋亡以及HGF表达的动态影响及其相互关系第一章持续高浓度氧对新生大鼠肺病理组织学及氧化的动态影响目的：观察持续吸入高浓度氧（高氧）对新生大鼠发育中肺的病理及肺组织内脂质过氧化物变化，来探讨高氧对新生鼠肺发育的影响。同时制备出新生鼠高氧致CLD模型。方法：新生SD大鼠生后12小时内分别于90％以上氧（HO组）和空气中（Air组）持续暴露，于3、7、14、21d，动态观察肺组织病理学改变和胶原染色面积的变化以及肺组织8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）含量。结果：与Air组比较，HO组肺泡发育受阻，表现为肺泡变大且结构简单化、肺泡数目减少、等肺泡发育不良的慢性肺疾病（CLD）病理表现，肺损伤逐渐加重，最终纤维化；胶原染色阳性面积7d时高于Air组，随时间延长而逐渐增加；8-iso-PGF2α含量3d时开始升高，7d时达最高，以后下降但至21d仍高于空气对照组。结论：1．高氧致新生鼠CLD的主要病理变化是肺泡发育障碍。2．氧自由基可能参与了CLD的发病过程。第二章HGF在持续高氧暴露新生大鼠肺组织中的动态表达及其与细胞凋亡的关系目的：动态观察高浓度氧（高氧）暴露新生鼠肺组织细胞凋亡情况、肝细胞生长因子（HGF）和其受体cMet的表达变化以及两者之间的相关关系，探讨HGF在新生鼠CLD发病中的作用。方法：新生SD大鼠出生后随机分为Air组和HO组（90％氧气），分别于生后3、7、14、21d留取肺组织标本。以TUNEL观察细胞凋亡变化，透射电镜观察肺泡Ⅱ型细胞的超微结构变化，免疫组化方法检测HGF、cMet蛋白表达，RT-PCR检测HGF、cMet mRNA表达。结果：3d时，HO组与Air组凋亡细胞数没有差异，7d起HO组高于Air组，并随着吸氧时间的延长凋亡细胞逐渐增加，21d达高峰。Air组AECⅡ表面微绒毛（microvilli，Mv）完整，胞浆内可见线粒体（mitochondria，Mi）和板层小体（lamellar bodies，LB）质膜连续完整，气血屏障正常完整，肺间质内无胶原沉积。HO组3d开始出现板层小体排空；7d除线粒体和板层小体改变外，出现凋亡的特征性改变，即：微绒毛减少，染色质浓缩，沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状。14d上述变化明显加重，线粒体嵴断裂，部分融解，板层小体基本排空，伴有气血屏障明显增厚；至21d时细胞核固缩、融解，板层小体彻底排空线粒体、微绒毛消失，肺间质有大量纤维组织增生。HGF蛋白主要在正常肺组织间质细胞中和支气管上皮细胞中表达，cMet蛋白主要在正常肺组织肺泡和支气管上皮细胞中表达。高氧暴露3d时，两组HGF、cMet mRNA及蛋白表达未见明显差异，7d，14d，21d时，HO组HGF、cMet mRNA及蛋白表达随着吸氧时间的延长逐渐升高，21d达高峰；各时间点均明显高于相应的Air组，差异有显著意义（p＜0.01）。HGF、cMet蛋白表达与其mRNA表达呈正相关，两者分别与肺组织细胞凋亡数也成正相关。结论：1．肺细胞凋亡参与了新生鼠CLD的发生、发展过程，同时也是导致高氧致CLD新生鼠肺泡发育障碍的原因之一。2．HGF及其受体与新生鼠正常肺发育过程有关。3．HGF参与了高氧肺损伤过程。4．HGF可能与肺细胞的凋亡过程有关。第二部分HGF对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用及机制探讨第一章早产鼠肺泡Ⅱ上皮细胞的分离纯化及原代培养和高氧细胞损伤模型的建立目的：探讨建立可靠的早产鼠肺泡Ⅱ上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定技术，并在此基础上建立肺泡Ⅱ上皮细胞高浓度氧（高氧）损伤模型，为从细胞水平研究高氧肺损伤的发病修复机制，进一步防治早产儿CLD奠定基础。方法：孕20d早产SD大鼠，引颈法处死，无菌条件下剖腹取出胎鼠，作为早产鼠。置无菌培养皿（无菌培养皿置于冰上），引颈法处死，迅速取鼠肺，去除非肺组织，清洗肺组织块，将肺组织块剪至1mm³大小先后用胰酶、DNAase及胶原酶消化成单细胞悬液，运用反复贴壁及差速离心法纯化出AECⅡ。经差速离心和反复贴壁法纯化AECⅡ，进行原代培养。用细胞角化蛋白、波形蛋白和表面活性物质蛋白C免疫细胞化学染色或免疫荧光染色以及透射电镜对纯化的AECⅡ进行鉴定。纯化后AECⅡ用含15％FCS的DMEM培养24h，弃去培养液和未贴壁的细胞，此时贴附在瓶底接近融合状态的AECⅡ用于实验。分为高氧组（HO组）和空气对照组（Air组），前者按5L／min通入95％氧、5％二氧化碳高纯混合气，10min后密封，与后者一起置于5％二氧化碳培养箱中培养24h，观察细胞生长情况，收取各组细胞培养上清作乳酸脱氢酶及8异前列腺素2α（8-iso-PGF2α）含量检测。结果：每5-7只20d胎龄早产鼠肺组织经分离、纯化贴壁后可获AECⅡ细胞数平均为（73±8）×10⁶，纯度高达89％±2％，0.4％苔盼蓝拒染实验检测接种细胞的活力为95％±1.1％。免疫荧光染色阳性信号为绿色荧光（角化蛋白）或红色荧光（SP C），免疫组化染色阳性为棕黄色颗粒，均定位于胞浆，AECⅡ细胞Cytokeratin（上皮来源细胞的标志性因子）SP C表达阳性，Vimentin（间质来源的标志性因子）表达阴性。电镜下可见20d早产鼠AECⅡ细胞内有特征性板层小体。HO组LDH活力比Air组稍有差别，但两组之间无显著性差异，说明在整个培养过程中细胞仍保留活力和完整性，但HO组8-iso-PGF2α量明显高于比空气组，表明高氧组细胞由于氧应激状态，引起了代谢产物的改变。结论：1．成功地分离、纯化及培养了原代早产鼠AECⅡ。2．成功建立了AECⅡ高氧的细胞损伤模型。第二章HGF对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡与功能的影响目的：探讨高氧暴露及HGF对体外培养早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡与功能的影响方法：MTT比色法检测不同浓度HGF对早产鼠AECⅡ细胞生长的影响，确定实验用HGF最佳浓度。20d早产鼠AECⅡ，经贴壁纯化后随机分为4组（每组五瓶）：空气组（Air）、高氧组（HO）、空气+HGF组（Air+HGF）、高氧+HGF组（HO+HGF）。HO、HO+HGF组在更换培养液后按5L／min通入95％氧、5％二氧化碳高纯混合气，10min后密封。Air+HGF、HO+HGF组在更换培养液时加入25ng／mlHGF（根据MTT实验结果），各组均置于培养箱（37℃，5％CO₂）中培养24h，收取各组细胞作流式细胞术法观察AECⅡ的增殖和凋亡情况，RT-PCR分析各组SPA、SPB、SPC mRNA表达。结果：MTT比色法显示，HGF在5～100ng／ml浓度范围内，促进细胞生长，在5～25ng／ml浓度范围内对AECⅡ生长的促进作用呈剂量依赖式，在25ng／ml～100ng／ml浓度范围内促进AECⅡ生长的能力基本一致。与Air组比，HO组Sub G1、G0／G1期细胞比例明显增高，G2／M期细胞比例明显降低，S期细胞比例无明显差异；Air+HGF组Sub G1、G0／G1、G2／M期细胞比例无明显差异，S期细胞比例明显增高。与HO组比，HO+HGF组Sub G1期细胞比例降低，G0／G1期细胞比例显著降低，S、G2／M期细胞比例明显增高。SPs mRNA RT-PCR结果显示，HO组AECⅡ细胞SP A、SP B、SP C mRNA表达水平显著低于Air组，Air+HGF组AECⅡ细胞SP A、SP B、SP C mRNA表达水平稍高于Air组，但差异无统计学意义。HO+HGF组AECⅡ细胞表达SP A、SP B、SP C mRNA明显高于HO组。结论：1、HGF可促进空气暴露的早产鼠AECⅡ细胞增殖，在一定范围内成剂量依赖性。2、高氧可导致早产鼠AECⅡ细胞增殖抑制，凋亡增加。3、高氧抑制早产鼠AECⅡ细胞肺表面活性物质蛋白的表达。4、HGF可部分逆转高氧对早产鼠AECⅡ损伤，促进早产鼠AECⅡ细胞增殖，凋亡减少；促进AECⅡ细胞肺表面活性物质蛋白的表达，因而对高氧所致早产鼠AECⅡ细胞损伤有保护作用。第三章HGF对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞保护作用的分子机制目的：在早产SD大鼠AECⅡ高氧损伤模型上运用RT-PCR、流式细胞检测及Western blot等方法检测PI-3K／Akt磷酸化阻断剂LY294002运用前后p-Akt、P21^CIP1、PCNA蛋白及Bcl-2、P21^CIP1、PCNA基因的表达，以及细胞周期的变化，探讨HGF对高氧损伤的AECⅡ保护作用的分子机制及可能的信号传导途径。方法：20d早产鼠AECⅡ，经贴壁纯化后随机分为4组（每组10瓶）：空气组（Air）、高氧组（HO）、空气+HGF组（Air+HGF）、高氧+HGF组（HO+HGF），每组随机抽取5瓶使用普通培养液，另5瓶使用含PI3／Akt阻断剂（LY294002）的培养液，HO、HO+HGF组按5L／min通入95％氧和5％二氧化碳的高纯混合气，10min后密封。Air+HGF、HO+HGF组在更换培养液时加入25ng／mlHGF，各组均置于培养箱（37℃，5％CO₂）中培养24h，收取各组细胞作流式细胞、RT-PCR及Western blot检测。结果：①阻断后HGF对高氧所致早产鼠AECⅡ细胞生长周期及凋亡的影响：与Air组比，HO组Sub G1、G0／G1期细胞比例明显增高，G2／M期细胞比例明显降低，S期细胞比例无明显差异，与阻断前相似；Air+HGF组Sub G1、G0／G1、G2／M期、S期细胞比例无明显差异；与HO组比，HO+HGF组Sub G1、G0／G1、G2／M期、S期细胞比例无明显差异。②阻断前后HGF及高氧对早产鼠AECⅡ细胞P21^CIP1、PCNA、Bcl-2蛋白及基因水平表达的影响：阻断前后HO及HO+HGF组PCNA蛋白及mRNA表达水平均显著低于Air组，P21 P21^CIP1蛋白及mRNA表达水平均显著高于Air组；阻断前HO+HGF组PCNA蛋白及mRNA表达水平高于HO组，P21^CIP1蛋白及mRNA表达水平低于HO组；阻断后HO+HGF的PCNA、P21^CIP1表达水平较HO组比较无显著差异。阻断前后HO、HO+HGF组Bcl-2mRNA表达水平均显著低于Air组；阻断前HO+HGF组Bcl-2mRNA表达水平显著高于HO组，而阻断后与HO组比较无显著差异。③阻断前后HGF及高氧对早产鼠AECⅡ细胞p-Akt蛋白水平表达的影响：阻断前与Air组相比，HO、Air+HGF及HO+HGF组AECⅡ细胞p-Akt蛋白表达显著升高；与HO组相比，HO+HGF组p-Akt蛋白表达明显升高。阻断后各组均未见p-Akt蛋白表达。结论：1、高氧引起AECⅡ增殖抑制与上调P21^CIP1、下调PCNA转录及翻译水平的表达有关。2、高氧引起的AECⅡ凋亡与其下调Bcl-2转录水平的表达有关。3、HGF能部分逆转高氧对P21^CIP1、PCNA、Bcl-2表达的影响。4、PI3-K／Akt信号传导通路参与了HGF部分逆转高氧对AECⅡ增殖凋亡影响的过程。