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巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri Hughes作为我国已商业化生产的本土植绥螨,具有取食范围广、扩散力强等优点。而球孢白僵菌Beauveria bassiana是应用最广泛的生防真菌之一,具有良好的防治效果。将两者进行联合应用是一种联合防控新途径,本课题组已筛选出球孢白僵菌的Bb025菌株对柑橘始叶螨具有高致病力却对巴氏新小绥螨侵染力较低,明确两者具有联合防控潜力。但巴氏新小绥螨对Bb025的耐受机理仍不明确,亟需探究。因此本研究以巴氏新小绥螨和Bb025为研究对象,利用RT-qPCR技术开展了Bb025诱导巴氏新小绥螨Toll通路的响应模式研究并利用克隆技术对Toll通路中起关键作用的Spz基因进行鉴定。还采用RNAi技术将Spz沉默后,检测Toll通路其他基因和抗菌肽的表达情况,明确了Spz在Toll通路中的作用。主要研究结果如下:1球孢白僵菌侵染对巴氏新小绥螨Toll通路的影响将巴氏新小绥螨喷洒或取食Bb025孢子液30 min后,利用PCR技术检测了它们体内的含菌(白僵菌)情况,同时设立了阴性对照和空白对照组,结果只有喷洒和取食组检出白僵菌片段,表明Bb025孢子液在30 min以内即可被巴氏新小绥螨取食。在明确Bb025的侵入方式后,利用RT-qPCR技术研究了Bb025侵染后巴氏新小绥螨Toll通路的响应模式,结果显示处理2 h后,PGRP、Spz、Toll3、Myd88、Tube和Pelle不同程度的显著上调表达,抗菌肽defensin也上调表达,表明此时Bb025被取食后侵染巴氏新小绥螨并诱导引发了巴氏新小绥螨Toll通路的免疫响应。4 h后,除Spz和Toll1外其余基因均下调表达,defensin却显著上调表达,表达量比2 h时更高,表明Toll通路基因已发挥作用并激活更多defensin产生。96 h后,Toll通路大部分基因和defensin再次不同程度的显著上调表达,表明此时Bb025通过巴氏新小绥螨体壁侵入并诱导引发了Toll通路的免疫响应。120 h后,除PGRP、Spz和Toll1保持上调外,其余基因的表达趋于平稳,defensin却呈现出更高的表达量,表明此时Toll通路基因已基本完成响应并诱导产生更多defensin以抵御侵染。综上所述,巴氏新小绥螨Toll通路在Bb025被取食或体壁侵入诱导引发的免疫反应中均发挥了重要作用,并且也发现Spz基因在Toll通路响应过程中发挥着重要作用。2巴氏新小绥螨Spz基因的克隆与不同螨态的表达谱解析基于转录组数据库筛选出Spz基因,利用RT-PCR技术克隆获得它的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其在巴氏新小绥螨体内作为胞外蛋白存在。通过多重序列比对发现,Nbspz含有7个半胱氨酸结构域,在进化过程中高度保守。通过构建系统发育树,发现Nbspz与同为蛛形纲的物种聚为一大支,表明它们的亲缘关系较近。还发现Nbspz与不同物种的Spz5相似度较高,表明Nbspz可能属于Spz type5家族。通过RT-qPCR技术研究了Spz在不同螨态中的表达谱,结果显示Nbspz在若螨、雌成螨和雄成螨中的表达量较高,表明Spz基因在巴氏新小绥螨若螨、雌成螨和雄成螨中为抵御病原菌的侵染发挥了重要的作用。3巴氏新小绥螨Spz基因在Toll通路中的功能验证通过饲喂法将巴氏新小绥螨进行RNAi,获得了61%的沉默效率。与此同时,Toll2、Toll3、Myd88、Tube和Pelle均出现了不同程度的下调表达,其中Toll2、Toll3和Myd88与对照组相比有显著性差异,同时defensin也受其影响随之下调表达。由此说明,Spz基因在巴氏新小绥螨Toll通路免疫应答过程中发挥着不可替代的作用。将Spz沉默并用Bb025处理后,巴氏新小绥螨的死亡率明显提高,缩短了LT50和LT95。处理后第7 d,当阴性对照组和空白对照组的累积死亡率分别为15%和15.6%的情况下,处理组的累积死亡率高达50.1%,表明RNAi后的巴氏新小绥螨对Bb025的敏感性明显提高。由此推断,Spz基因及Spz基因所在的Toll通路在巴氏新小绥螨应对Bb025侵染过程中发挥着相当重要的作用。