白介素2重组腺病毒转染膀胱移行上皮预防大鼠膀胱癌的实验研究 一、背景 膀胱癌在我国为最常见的泌尿系统恶性肿瘤，近年来其发病率呈不断上升的趋势。膀胱癌的显著特点是复发率高，即使早期接受手术及术后行膀胱灌注化疗，仍有20～30％以上的表浅性膀胱移行细胞癌最终发展为肌肉浸润性膀胱癌，因此如何预防膀胱癌的复发已经成为这一领域中的研究热点。 近十多年来，作为一种新的治疗途径，人们在膀胱癌的基因治疗方面进行了许多研究。由于膀胱是半开放器官，通过尿道直接和外界相通，具备膀胱腔内直接灌注治疗的优势；膀胱癌术后易复发，并可以通过膀胱镜检查及取活检而及时作出诊断，有利于观察基因治疗的疗效。因此膀胱肿瘤的基因治疗较其他部位的肿瘤更易应用于临床。 将细胞因子基因作为目的基因导入靶细胞，使其在宿主体内或肿瘤局部持续产生一定量的细胞因子而达到治疗目的的方法是目前膀胱癌基因治疗的重要策略之一。细胞因子基因疗法通过促进宿主免疫活性细胞的分化、增殖并增强其功能，使肿瘤细胞和免疫活性细胞之间的免疫反应持续存在，从而直接杀死癌细胞或促使癌细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。 IL-2是具有广泛生物学活性的细胞因子，它能够促进T细胞的体内增殖；诱导并增强NK细胞的增殖和杀伤活性；促进B细胞分化、增殖和产生抗体。是具有明确抗肿瘤作用的细胞因子，也是目前为数不多的已应用于临床抗肿瘤治疗的细胞因子。 基因治疗的有效性，与选择有效的治疗基因有关，更重要的就是要选择恰当的载体将目的基因携带至靶细胞并高效和较长时间地表达。腺病毒载体系统具有对人类安全、构建简单、感染效率高、使用方便的突出特点，是目前基因治疗常用的载体，而且，腺病毒具有嗜膀胱细胞的特性，而膀胱又是一个半开放器官，这使应用腺病毒载体经尿道膀胱灌注转染膀胱移行上皮成为可能。 二、目的 本研究在利用MNU行大鼠膀胱灌注成功构建大鼠膀胱癌模型的基础上，应用携带IL-2基因的重组腺病毒体内转染膀胱移行上皮细胞，使目的基因长期而有效地表达，增强机体的局部免疫反应，降低膀胱癌的发生率，预防膀胱癌的复发。为IL-2重组腺病毒应用于膀胱癌的基因治疗提供实验依据。 三、方法 (1) 选用体重约250克的SD雌性大白鼠30只，随机分为两组：01级硕士论文白介素2重组腺病毒转染膀耽移行上皮预防大鼠膀耽癌的实验研究一组20只，行MNU膀肤灌注，Zmg/次，每两周一次，共4次;另一组10只，同法行PBS灌注。第十周处死所有大鼠，切除膀肤，肉眼观察大体变化，HE染色后镜下观察细胞形态变化，区分肿瘤类型。(2)培养HEK293细胞，扩增AdvIL一2和AdvLac一z病毒;选用体重约250克的SD雌性大白鼠60只，将其随机分为四组，每组各巧只:每组第1、3、5、7周均行MNU膀肤灌注，Zmg/次;第2、4、6、8周分别行PBS、AdvLac一Z、IL一2和AdvIL一2膀肤灌注。第十周将四组大鼠处死，切除膀肤，比较各组大鼠膀肤成瘤率、最大瘤体直径等肿瘤相关指标的差异，HE染色后镜下观察细胞形态变化和肿瘤类型，同时用RT~PCR方法检测AdvIL一2组大鼠膀肤组织中IL一ZmRNA的表达。 四、结果(l)诱癌组在第十周剩余大鼠18只，16只大鼠膀肤肉眼可见肿物，成瘤大鼠肝脏、脾脏、双侧肾脏肉眼均未见到肿块，1只大鼠可见双侧输尿管肿块。对照组10只大鼠膀肤未见肿物生长。HE染色示诱癌组16只大鼠膀肤发生癌变，其中11只为膀肤移行细胞癌;3只为鳞癌合并移行细胞癌;2只为鳞癌。对照组10只大鼠膀肤切片未见肿瘤细胞。(2) AdvIL一2、AdvLac一Z病毒在HEK 293细胞中反复扩增及纯化后，经空斑实验检测病毒滴度分别为:AdvIL一2滴度为1.sxlogpfil八111，对照病毒AdvLac一z滴度为o.75xlogpfil八111。四组大鼠实验结果显示:AdvIL一2治疗组在大鼠膀肤成瘤率、最大瘤体直径等指标优于PBS组和AdvLac一z组，p<0.05;优于IL一2治疗组，但没有统计学差异，p>0.05。RT~PCR结果显示AdvIL一2组3只大鼠在行AdvIL一2膀肤灌注后第5天其膀肤组织内均有IL一ZmRNA的表达，而作为对照的AdvLac一Z、IL一2组大鼠膀肤组织内未检测到IL一ZmRNA的表达。 五、结论(l)本研究应用经尿道膀肤灌注MNt]的方法成功构建了大鼠膀肤癌模型。MNt]诱发大白鼠膀肤发生肿瘤的过程与人类相似，都是由于尿中的化学物质刺激膀肤上皮从而引起膀肤肿瘤发生。因此，通过应用MNt]构建了大鼠膀肤癌模型，有利于对膀肤肿瘤病因、病理、预防和治疗等多方面的研究。 (2) AdvIL一2在灌注大鼠膀肤5d后，仍可检测到IL一ZmRNA的表达。不同干预因素对预防大鼠膀肤癌的实验结果表明:AdvIL一2治疗组在膀肤成瘤率、最大瘤体直径等指标优于PBs组和AdvLac一z组，p<0.05;优于IL一2治疗组，但没有统计学差异，p>0.05。提示腺病毒介导的IL一2基因转染膀肤移行上皮对MNU致大鼠膀肤癌的发生具有较好的预防作用。为AdvIL一2应用于临床预防膀肤癌复发提供了实验依据。 关键词膀肤癌白介素2腺病毒基因治疗