雌激素是对一组甾体类激素的总称,人体内的雌激素主要包括雌酮(estrone, E1)、17α-雌二醇(17a-estradiol、17β-雌二醇(17p-estradiol, E2p),雌三醇(estriol, E3)等。雌激素是重要的女性激素,其主要生理作用包括促进女性性器官的发育成熟,维持女性第二性征,调节女性生殖周期等。随着生命科学的发展,人们对雌激素的认识也逐渐深入。研究发现,雌激素的生物学作用广泛,参与人体多个系统功能,包括调节骨骼及脂类代谢,维持心血管稳态等。在神经系统中,雌激素同样发挥着重要的作用,包括促进神经元细胞生长、分化,调节神经内分泌,维持神经系统的稳态以及神经保护作用等。本研究主要关注雌激素的神经保护作用。雌激素通过与雌激素受体(Estrogen receptor, ER)结合而发挥效应。经典的雌激素受体包括雌激素受体ER-α(主要指ER-a66)及ER-β。ER-α及ER-β均定位于细胞核,是核雌激素受体。ER-α36是2005年Dr. Wang研究小组发现并克隆的新型雌激素受体,主要定位于细胞膜,是ER-α的一个全新亚型。作为一种新型的雌激素受体,ER-α36已被证实在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用,但其在神经系统中的作用至今尚未见报道。虽然多项研究已经证实雌激素具有神经保护作用,但相关作用机制尚未完全明了,对介导雌激素神经保护作用的关键受体也一直存在争议。本课题采用过氧化氢(H202)处理人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y及IMR-32建立神经细胞损伤模型,同时采用17β-雌二醇及ER-α36特异性激动剂(G1)处理细胞,明确雌激素在神经保护作用中的关键受体,研究雌激素神经保护作用的分子机制,为神经退行性疾病及神经细胞损伤的治疗提供新思路及新的药物作用靶点。[研究背景]多项针对神经系统疾病的研究证实,雌激素具有明确的神经保护作用。临床调查显示,接受雌激素替代治疗的妇女患帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的风险显著下降；另有报道雌激素替代治疗可以降低绝经期女性阿尔茨海默(Alzheimer’s disease,AD)的患病率；雌激素还能有效缓解脑损伤或脑缺血中风造成的神经元死亡现象。神经系统退行性病变往往伴随有神经炎症的发生,有研究发现雌激素具有对抗神经炎性损伤的作用。随着体内雌激素水平的下降,绝经期妇女更易发生包括神经炎症在内的多系统炎症,而适当剂量的雌激素治疗则可以显著缓解此类炎症反应。雌激素的神经保护及抗神经炎症作用,是现代神经生物学的重要研究方向之一,对于全面揭示雌激素的生物学功能,研发有效的、靶向性神经退行性疾病治疗药物具有重要意义。雌激素与雌激素受体结合发挥生物学作用,主要涉及两种不同的分子机制：1)基因组作用模式,即雌激素进入细胞与受体结合后,转移入核,对靶基因发挥转录调控作用；2)非基因组作用模式,即雌激素通过与细胞膜上的雌激素受体结合,诱导一系列激酶活性,激活细胞内信号通路而发挥作用。经典的雌激素受体包括雌激素受体-α(Estrogen receptor-α, ER-α,包括ER-α66和ER-α46两种亚型)和雌激素受体-β(Estrogen receptor-β, ER-β),这两类受体都是核受体家族成员,主要参与雌激素的基因组作用模式。虽然已经明确非基因组作用模式在雌激素神经保护中发挥重要作用,但是受经典雌激素受体理论的限制,人们对非基因组作用模式在神经系统中的作用及相关机制研究仍然不够深入。[研究目的]采用H2O2分别处理SH-SY5Y和IMR-32细胞建立神经细胞损伤模型,观察E2β及ER-α36特异性激动剂G1对损伤细胞的保护作用,初步明确ER-α36是否参与了雌激素神经保护作用；在此基础上通过干扰细胞内ER-α36表达及建立ER-α36高表达细胞株进一步研究ER-α36在雌激素神经保护中的作用,并研究其相关分子机制。[研究方法]采用250μM H2O2分别处理SH-SY5Y及IMR-32细胞建立神经细胞损伤模型,然后用10nM的E2β及G1处理细胞,MTT法和流式细胞术分别对细胞的存活率和凋亡情况进行检测,建立研究雌激素神经保护作用的细胞模型,初步明确ER-a36是否参与雌激素神经保护作用。采用Western blotting检测E2β及G1处理细胞后不同时间点PI3K/AKT和MAPK/ERK通路的激活情况,明确与E2β神经保护作用相关的非基因组快速反应通路。在此基础上建立ER-a36干扰细胞株及高表达细胞株,Western blotting观察E2p及G1处理后,雌激素快速反应通路激活情况的变化,明确ER-a36是通过介导雌激素的非基因组信号通路发挥神经保护作用。[研究结果](1)MTT检测结果表明E2p及G1能显著减少H2O2损伤引起的细胞存活力下降,发挥细胞保护作用；在ER-a36干扰细胞株,E2β及G1的保护作用被显著抑制,而在ER-a66干扰细胞株中E2p及G1的保护作用不受影响。(2)流式细胞计数结果表明E2p及G1能显著减少H202损伤引起的细胞凋亡；在ER-a36干扰细胞株中E2β及G1不能减少H202损伤引起的细胞凋亡,而在ER-a66干扰细胞株中E2β及G1的这一作用基本不受影响。(3) Western blotting结果表明E2p及G1能在5分钟内快速激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路,而在ER-α36干扰细胞株中E2p及G1的这一作用被显著抑制；在ER-α66干扰细胞株中E2p及G1的这一作用基本不受影响。该结果表明ER-a36参与介导了雌激素的非基因组快速效应。(4)建立ER-a36高表达细胞株,干扰该细胞株中GPR30表达,Western blotting结果发现E2p及G1仍能迅速激活该种细胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路。这一结果表明GPR30没有参与ER-a36介导的雌激素快速反应通路的激活过程。[结论]ER-a36参与了雌激素的神经保护作用,并介导了雌激素的非基因组快速反应,包括激活MAPK/ERK和PI3K/AKT等快速信号通路；GPR30没有参与ER-a36介导的雌激素快速反应通路的激活过程。