鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种严重的全身性感染疾病,其在发达国家已较少存在,主要分布于发展中国家,如非洲和亚洲等。在我国,鸡白痢沙门菌仍是严重影响家禽业的致病菌之一。抗菌药物的使用是防治鸡白痢的重要措施,但其滥用导致耐药性的不断增强,而且耐药性可能通过食物链传播到人类。细菌耐药性包括先天耐药和获得性耐药。获得性耐药相关基因通常位于可移动元件上,携带耐药因子的质粒是传播耐药性的重要途径。沙门菌耐药性的产生和增强,对鸡白痢等的防治是一个不利因素,但目前关于鸡白痢沙门菌耐药性监测及其耐药机制的报道较少,研究数据相对匮乏。为了解我国鸡白痢沙门菌耐药性流行状况及其耐药机制,本研究通过分析1962-2015年间我国不同地区来源的鸡白痢沙门菌耐药特性和多重耐药状况,并对部分国内外菌株耐药性进行比较,初步掌握了我国鸡白痢沙门菌总体耐药状况与趋势；另外,通过对50株测序菌株全基因组进行序列分析,获得了主要耐药基因,分析其与耐药性之间的关系,同时发现一个鸡白痢沙门菌特有的耐药质粒pSPUR。1.我国部分地区鸡白痢沙门菌耐药性测定与分析本研究测定了我国部分地区1962-2015年间的423株鸡白痢沙门菌对18种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),结果显示我国鸡白痢沙门菌对萘啶酸的耐药率最高,达到69.3%,其次为四环素(43.8%)；对氨苄西林、阿莫西林／克拉维酸、复方新诺明、头孢唑啉、环丙沙星和氨曲南的耐药率也较高,分布在5.2%-22.0%之间；对头孢噻呋、美罗培南、丁胺卡那霉素、氯霉素和喹乙醇的药物敏感性较好,耐药率均未达到1%；而对其余四种抗菌药物(卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星和呋喃妥因)的体外抑菌效果最好,无耐药菌株出现。我国鸡白痢沙门菌对氨曲南、四环素和萘啶酸的耐药率随时间逐渐升高。对四环素、萘啶酸和复方新诺明耐药的菌株主要分布在1998年及之后,对萘啶酸的耐药率自2009年至今基本维持在100%；而对环丙沙星耐药的菌株最初出现在2006年,其后耐药性一直处于较稳定的低水平状态。对p-内酰胺类药物的耐药性则是先降低后升高的趋势。对其余抗菌药物的耐药率虽较低,但MIC值发生变化。如环丙沙星和恩诺沙星的MIC50分别为0.015-0.03-0.03-0.03-0.5-0.5μg/mL和0.03-0.03-0.06-0.06-0.5-0.5μg/mL；呋喃妥因的MIC50和MIC90均逐渐升高：8-8-16-16-16-16μg/mL和16-16-16-16-32-32 μg/mL。我国鸡白痢沙门菌的多重耐药性总体呈现上升趋势。上世纪90年代以前的多重耐药菌株仅出现在1960-1969年间,多重耐药率为13.3%。随后多重耐药菌株开始增多,多重耐药率逐渐升高：从1990-1999年间的12.2%上升至2000-2009年间的37.4%,直至2010-2015年间的47.3%,并开始出现对4-5类抗菌药物耐药的菌株。多重耐药菌株主要对p-内酰胺类、四环素类、磺胺类和喹诺酮类抗菌药物表现耐药。将我国鸡白痢沙门菌与欧洲和南美洲部分国家同时期菌株的耐药性进行比较分析。欧洲菌株和南美洲菌株中分别有1株和2株对链霉素和萘啶酸耐药,而我国同时期菌株耐药率分布在7.1%-28.6%和3.6%-28.6%之间,明显高于欧洲和南美洲菌株。2.50株鸡白痢沙门菌耐药基因分析通过BLASTn将全基因组测序的50株鸡白痢沙门菌序列与耐药基因库ARDB进行比对,预测各菌株相关的耐药因子。匹配值选取80%,得到50株共有的2种多重耐药外排泵(MdtK, SdeY)、3种多重耐药外排蛋白(AcrB-TolC,MdtG,EmrD)、1种移位酶(MdfA)和春日霉素耐药基因ksga。预测到与18种测定抗菌药物相关的4种耐药基因分别为aph33ib、tetA、blaTEM-1和sull/2,分别决定链霉素、四环素、青霉素类药物和复方新诺明耐药性。在17株含有这些耐药基因的菌株中,16株与耐药表型一致。链霉素和氨苄西林的基因型和耐药表型符合率均为100%,四环素的符合率为92%。MIC试验中对磺胺类药物表现耐药的菌株均含有染色体上基因sull,而含有质粒上耐药基因sul2和无耐药基因菌株的MIC值为<0.06/1.2-1/19,未达到耐药折点。在喹诺酮耐药决定突变区(QRDR)的基因中,gyrA中发生突变主要在83位(S83F),且发生该突变菌株对萘啶酸均表现耐药,对环丙沙星的MIC值(0.25-1 μg/mL)也高于其它菌株。在gyrA其它位点和parE中发生的突变对喹诺酮类药物耐药性无影响,parC基因中突变的作用无法确认,gyrA中83位氨基酸的突变是影响鸡白痢沙门菌对喹诺酮类药物耐药性最重要因素。3.鸡白痢沙门菌特异性耐药质粒鉴定通过上述全基因序列分析发现在对氨苄西林高水平耐药(MIC值≥512 μg/mL)的菌株(S9303, S9804, S98109, S09c6, S09c12, S09c13, S09c15)中存在一个新的特异性耐药质粒pSPUR,大小在30-50 kb之间,结构相似,且在鸡白痢沙门菌中未报道。该质粒上的主要耐药基因为blaTEM-1,并含有IS1、IS240、Tn3和InsA四种转座酶。该质粒序列主要来源于两类质粒。质粒接合试验(受体菌分别为S06004和J53AziR)中仅获得一株受体菌为S06004的接合子,显示该质粒可能具有种属特异性。该质粒的转移使受体菌S06004对氨苄西林的MIC升高1024倍,对阿莫西林／克拉维酸也升高了32倍。电转试验中,转化子使受体菌J53AziR对氨苄西林、阿莫西林／克拉维酸和头孢唑啉的MIC值分别升高≥512、128-256和16-256倍,且相对于供体菌也有所升高。这些结果显示该质粒具有接合转移能力,并且可能在鸡白痢沙门菌中引起青霉素类药物耐药性的传播。