咖啡碱,学名2,6-二氧1,3,7-三甲基黄嘌呤,是多种高等植物体内重要的生物碱,同时也是茶叶中含量最多的嘌呤碱。由于咖啡碱具有兴奋、助消化等功能,被广泛应用于药物、食品中。目前,市场上咖啡碱的主要来源是植物提取或化学合成的咖啡碱是,但这些方法都存在弊端。因此,利用微生物发酵成为生产天然无污染咖啡碱的新途径。然而,在构建工程菌发酵过程,由于咖啡碱的抑菌活性从而影响工程菌的发酵效率,使得咖啡碱得率有限。此外,对于普洱茶加工而言,其品质形成的关键工艺是渥堆发酵,而茶叶的渥堆发酵过程中有大量微生物参与,且在此过程茶叶中一些特征性内含成分会发生一定变化。据报道,茶叶中的咖啡碱在渥堆过程中有增长趋势,那么这种增长是否有微生物有关?前期研究结果表明在微生物体内存在一条咖啡碱通路,其甲基化顺序为N3→N1→N7。本文以研究微生物中咖啡碱代谢为出发点,探索参与普洱茶渥堆发酵过程的微生物是否存在咖啡碱生物合成途径以及提高工程菌生产咖啡碱产量的策略。通过同位素示踪法,外源添加稳定性同位素黄嘌呤进行普洱茶模拟渥堆发酵,从而探索渥堆过程中微生物的咖啡碱代谢通路,进一步明晰咖啡碱在渥堆过程中有所增长的生物学机理;以及通过克隆mutBfr1并进行生物信息学分析,导入大肠杆菌中验证其抗咖啡碱能力;通过基因工程串联表达TCS1基因和bfr1基因,研究其提高工程菌生产咖啡碱得率的效果。研究取得的主要结果如下:(1)通过外源添加嘌呤前体,进行普洱茶模拟渥堆发酵的研究结果表明:添加黄嘌呤(0.1 mg/g)的茶样中,可可碱增加了 49.89%,而咖啡碱增加了 36.57%;茶样中添加黄嘌呤(1 mg/g),可可碱和咖啡碱分别增加了 53.56%和37.86%。而无外源黄嘌呤添加的茶样中,可可碱和咖啡碱分别增加了 43.56%和32.56%。然而,当茶样进行灭菌处理后,其茶样中可可碱和咖啡碱的含量基本维持恒定,表明微生物是普洱茶中咖啡碱的含量增加的主要因素。通过稳定性同位素示踪法,发现添加15N-黄嘌呤的茶样中可以检测到15N-可可碱和15N-咖啡碱的存在,而未添加15N-黄嘌呤的茶样中,则未检测到同位素标记的物质。结果表明普洱茶渥堆发酵过程可能存在一条微生物催化黄嘌呤转化为可可碱再到咖啡碱的代谢通路。(2)利用生物信息学手段对本课题组前期获得的mutBfr1基因进行分析,结果如下:mutBfr1基因与野生型bfr1基因的核苷酸序列相比较,存在13个碱基突变;mutBfr1蛋白GRAVY的预测值为-0.161,表明该蛋白为亲水性蛋白;共有12个残基区出现预测值较高的跨膜特征,很大可能是跨膜螺旋区;将mutBfr1基因导入大肠杆菌中表达,基于平板点样和菌株的生长曲线的绘制的结果,表明大肠杆菌可耐受8 mg/mL的咖啡碱,可以降低菌株对咖啡碱的敏感性。(3)利用同源重组技术,在大肠杆菌中将mutBfr1和咖啡碱合成酶基因(TCS1)进行串联表达。实验结果表明,目的菌株BL21/pMAL-eCS1和BL21/pMAL-eCS1-mutBfr1经无底物发酵培养后,胞外有咖啡碱的生产,而胞内未检测到咖啡碱。在培养基中添加底物茶叶碱,重组菌株相较于均检测到咖啡碱的生产。经咖啡碱定量分析可得 BL21/pMAL-TCS1产咖啡碱(6.28± 1.21)μg/mL、BL21/pMAL-TCS1-mutBfr1产咖啡碱(6.15±1.15)μg/mL、BL21/pMAL-eCS1 产咖啡碱(22.28±1.21)μg/mL 和BL21/pMAL-eCS1-mutBfr1产咖啡碱(20.84±1.74)μg/mL。结果表明mutBfr1与TCS1串联表达的菌株产咖啡碱的能力并未高于仅表达TCS1的菌株。同时,对胞内产物进行UPLC检测分析,结果并未检测到咖啡碱。