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鸡球虫病是由顶复器门艾美耳属的鸡球虫感染所引起的,主要感染于家禽。球虫病严重降低动物的生长速度和饲料利用率,从而导致其生产率的下降,给世界家禽业造成巨大的经济损失,每年因鸡球虫病引起的经济损失超过30亿美元。该病常见控制措施为药物预防,或者使用活疫苗,但药物与预防存在着药物残留及耐药性的缺点,活苗存在着的安全性及成本高等缺点。新型疫苗(DNA疫苗和亚单位疫苗)越来越受到人们的重视。临床上鸡球虫病多为混合感染,实用有效的疫苗应该能够抵抗多种球虫感染。在本实验室前期研究中,用免疫蛋白组学的方法,筛选出了E.tenella、E.acervulina和E.maxima 3种球虫的共同抗原,本研究选择其中的一个共同抗原,GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase),该共同抗原的核苷酸序列在这3个种之间的同源性都在91%以上,为评估该共同抗原抵抗多种球虫感染的免疫保护效果,研制球虫多价新型疫苗提供候选抗原,特进行以下研究:利用PCR技术成功扩增EaGAPDH和EmGAPDH基因,并利用DNA重组技术构建EaGAPDH和EmGAPDH基因的原核表达质粒pET32a-EaGAPDH和pET32a-EmGAPDH,在原核表达系统(大肠杆菌)中成功诱导表达。免疫印迹试验结果显示重组蛋白能够被自然感染鸡球虫的鸡血清所识别。本研究利用DNA重组技术,将共同抗原GAPDH基因分别连接到真核表达载体pVAX1.0中,分别构建真核重组质粒pVAX-EaGAPDH和pVAX-EmGAPDH,从真核表达水平(真核表达质粒)对共同抗原的免疫原性进行分析。用真核表达质粒进行肌肉注射免疫14日龄雏鸡,设置对照组PBS组和pVAX空质粒组,21 E日龄二次免疫,从细胞免疫水平、体液免疫水平综合评估共同抗原的免疫原性,用构建的真核重组质粒pVAX-EaGAPDH和pVAX-EmGAPDH进行动物保护性试验,研究鸡球虫共同抗原对多种球虫感染的抵抗效果。首次免疫后第7天和第2次免疫后第7天分离鸡脾脏淋巴细胞,CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例的检测使用流式细胞术方法。结果显示,首免后7天及第二次免疫后7天,免疫组的脾脏中CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例均高于对照组,且两者差异显著,证明构建的DNA疫苗促使鸡体内的T淋巴细胞中CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例升高。此外,提取淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR,通过分析Th1类细胞因子(IFN-y和IL-2)的mRN A水平、Th2类细胞因子(IL-4)的mRNA水平及其他细胞因子(TNFSF15、IL-17和TGF-β4)的mRNA水平,发现免疫组的细胞因子转录水平与对照组相比,差异显著,且高于对照组的mRNA水平。说明构建的真核重组质粒能够促进鸡体内的细胞因子的分泌。第一次免疫后1周及第二次免疫后1周分别通过心脏穿刺采血,用间接ELISA方法测定血清特异性抗体IgG水平。结果显示一免后1周,免疫组与对照组相比较,实验组IgG抗体水平显著高于对照组;二免后1周,实验组的抗体水平显著高于对照组。综上,构建的真核重组质粒能够参与鸡体内的体液免疫,并引起体液中IgG抗体水平的升高。14日龄雏鸡经腿部肌肉注射真核重组质粒pVAX-EaGAPDH和pVAX-EmGAPDH 100 μg/羽,21日龄第二次免疫。除非免疫非攻虫组外,其余28日龄分别经口接种新鲜的E.tenella、E.acervulina、E.maxima和3种球虫混合孢子化卵囊。所有实验鸡于6天后剖杀,结果显示,重组质粒免疫组感染3种球虫或混合感染后的ACI值均处于160以上,构建的真核重组质粒对鸡抵抗多种球虫感染的免疫保护效果一般。