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茶陵野生稻是世界分布最北的两个野生稻居群之一,耐冷性极强。研究茶陵野生稻中表达出对低温胁迫有抵抗能力的目的基因,不但可为栽培稻的对抗低温冷害的能力提升提供基因资源,而且可加深人类对野生稻耐冷分子机制的理解,具有非常重要意义。
OrCr3(Oryza rufipogon cold responsive gene3)是通过基因芯片分析从茶陵野生稻(Oryza rufipogon Griff)中发现的一个受低温诱导而显著上调的耐冷候选基因。
以茶陵野生稻信使RNA为模板,通过RT-PCR法获得了OrCr3基因完整开放阅读框(open reading frame)的cDNA克隆;根据它的开放阅读框序列进行在线预测,OrCr3基因编码一个由369个氨基酸残基组成的可能的山梨糖醇脱氢酶,理论分子量为39.3kD,pI=6.03,该酶催化山梨糖醇向果糖的转变;经蛋白质相似性比对,其编码蛋白与日本晴NM_001068947基因编码的蛋白NP_001062412的氨基酸序列完全相同,相似性为100%;对OrCr3基因启动子区域序列进行分析,发现了多种可能与逆境应答相关的顺式作用调控元件。
为了探明OrCr3这个低温应答基因是否具有耐冷或其它作用,构建了由2×CaMV35S组成型启动子驱动的pCAMBIA1300-OrCr3及pCAMBIA1301-OrCr3基因启动子植物表达载体,并通过农杆菌介导法转化了粳稻品种日本晴,获得了转OrCr3基因及其启动子T0代水稻日本晴植株。利用T0代转基因水稻日本晴植株开展了表型分析,实验研究最终结果显示:转OrCr3基因水稻植株经过低温处理后其可溶性糖含量与脯氨酸含量增加的百分率均高于非转基因的日本晴对照,而在相对电导率增加的百分率低于非转基因的日本晴对照;在非逆境下,二者农艺性状无显著差异。对转OrCr3基因启动子T0代水稻日本晴植株组织器官的GUS染色分析表明,该基因主要在叶鞘、茎、颖壳、花药、根、胚和胚乳中表达,而在叶中不表达。