骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤,也是骨科学界治疗的难点之一。据我国统计资料显示,骨肉瘤发病率在原发性恶性骨肿瘤中占居首位。该瘤恶性程度甚高,预后极差,可于数月内出现肺部转移,截肢后3-5年存活率仅为60%左右。虽然近年来骨肉瘤在病因、发生发展、诊断和治疗等方面有了一些进展,但进展十分缓慢,具体发病机制仍然不清楚。其次缺少骨肉瘤诊断和治疗的有效靶标,进一步寻找生物靶标,将具有重要的理论和临床应用价值。同时如能获得骨肉瘤血清诊断标志物,将对骨肉瘤的诊断和治疗带来深远的影响。microRNA是一种不编码蛋白质的,约21-25nt大小的单链小分子RNA。通过特异性的结合靶基因来调控其表达。从1993年,第一个microRNA:lin-4被发现后,在过去的几十年,大量的microRNA被发现并认为在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。近期研究表明,microRNA的表达变化与肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关。在不同的肿瘤类型中,microRNA呈现两种不一样的角色：抑癌基因和癌基因。主要的作用机制包括：microRNA位点的缺失、扩增、突变,表观遗传水平改变,转录调控因子的异常表达等。值得关注的是,microRNA具有一个重要特性,即在血浆和血清中非常稳定,不会被RNA酶降解。这使得其实际值与病人身上所得的测试值吻合的很好,如果能在外周血标本中找到特异性表达模式的microRNA生物标记物,对于早期诊断和治疗肿瘤具有重大的意义。STAT3蛋白是一种重要的转录因子,在生理状态下,STAT3激活快速而短暂,对于正常细胞的生理功能起着关键性作用。STAT3是EGFR、IL26/JAK、 Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点,在多种肿瘤细胞中均发现有持续性过度激活。STAT3过度激活后诱导细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因异常高表达,通过各种途径促进细胞增殖、恶性转化、阻碍细胞凋亡。STAT3激活可上调多种抗调亡基因(c-myc)、细胞周期调节基因(cyclin D1/D2)等,通过诱导转移相关基因MMP、VEGF等表达来促进肿瘤的转移和血管生成。而且STAT3与肿瘤的临床生物学行为如肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤细胞的耐药性等相关。本课题利用]microRNA表达芯片技术比较了六例骨肉瘤组织标本与癌旁组织分化成熟区域,发现miR-125b在骨肉瘤病人肿瘤细胞中表达显著下调。我们推测miR-125b在骨肉瘤的发生发展中具有重要的作用,即潜在抑癌基因的功能。本课题组的前期实验已经证明miR-125b能明显抑制骨肉瘤的增殖,迁移,但作用机制不明。通过生物信息学分析,我们发现STAT3的3’UTR有一保守的miR-125b结合位点,提示STAT3可能为miR-125b的候选下游靶基因。同时我们发现miR-125b的核心启动区具有CAAT元件,两个STAT3结合位点,一个STAT6结合位点,提示STAT3可以特异性结合于miR-125b核心启动子区域。综上所述,STAT3可以转录激活miR-125b,同时STAT3自身受到miR-125b转录后抑制调控,我们推论STAT3-miR-125b之间可能存在反馈调节环路。生理状态下,细胞不需要过多的STAT3,STAT3受miR-125b转录后抑制；过多的STAT3可通过转录激活产生更多的miR-125b,抑制STAT3而达到、维持miR-125b-STAT3间稳态平衡。骨肉瘤细胞中,STAT3表达高而miR-125b表达下降,为什么持续激活的STAT3不能反馈转录激活miR-125b?进一步分析表明miR-125b启动子具有CpG岛,该反馈调节环路可能由于肿瘤细胞中启动子表观遗传调节而打断。本课题通过两部分来研究STAT3-miR-125b反馈调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制以及骨肉瘤患者中血清microRNAs生物标记物的筛选。第一部分：miR-125b-STAT3调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制研究：(1)miR-125b-STAT3环路在骨肉瘤组织和细胞中的表达；(2)miR-125b靶向调控下游基因：STAT3;(3)STAT3对miR-125b的转录激活作用；(4)骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域甲基化状态。第二部分：血清microRNA作为骨肉瘤生物标记物的研究。通过这些研究,揭示miR-125b-STAT3反馈调节环路在骨肉瘤发生、发展中的作用机制,发现潜在的治疗靶标和可供诊断参考的生物标志物,有望为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供新的策略和方法。第一部分miR-125b-STAT3调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制研究第一节miR-125b-STAT3环路在骨肉瘤组织和细胞中的表达目的：研究骨肉瘤组织和细胞系中miR-125b和STAT3的表达水平。方法：通过实时定量RT-PCR法,在骨肉瘤和癌旁组织二组样品中以及骨肉瘤的三种细胞系,检测miR-125b的表达水平。其次,通过免疫印迹法(Western blot)检测骨肉瘤组织和细胞系中STAT3的蛋白水平。结果：与癌旁组织相比,骨肉瘤组织中miR-125b水平显著降低。与HEK-293细胞系相比,骨肉瘤的三种细胞系(MG-63,Saos-2, U2-OS)中miR-125b水平显著降低。与癌旁组织相比,骨肉瘤中STAT3蛋白表达水平显著升高；与HEK-293细胞系相比,骨肉瘤的三种细胞系(MG-63,Saos-2,U2-OS)中STAT3蛋白表达水平均显著提高。结论：骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中,miR-125b表达水平显著降低,而STAT3的表达水平显著升高。此结果提示二者可能参与骨肉瘤的发生、发展过程。第二节miR-125b靶向调控下游基因STAT3目的：验证STAT3为miR-125b的下游靶基因。方法：1.我们运用Targetscans/PICTAR等靶基因预测软件预测miR-125b的下游靶基因可能为STAT3。2.构建荧光素酶表达载体将STAT3的3’UTR区包含可能与miR-125b结合的一段序列克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector载体内,从而构建STAT3野生型(STAT3WT-luc)荧光素酶报告基因质粒。而后通过点突变的方法使STAT3的3’UTR区包含可能与miR-125b结合的一段碱基序列发生突变,构建STAT3突变型(STAT3MUT-luc)荧光素酶报告基因质粒。采取脂质体转染的方法将STAT3WT-luc和STAT3MUT-luc与miR-125b模拟物(miR-125b mimics)和阴性对照(Negative control)同时转染到MG-63细胞内。转染48小时后收取细胞,本实验采取双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参,检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。3.采用脂质体转染的方法将不同浓度miR-125b模拟物(miR-125b mimics)转染到Saos-2细胞内,采用蛋白质印迹(Western blot)检测STAT3蛋白表达水平；CKK8法检测细胞增殖活性。4.采用脂质体转染的方法将miR-125b模拟物(miR-125b mimics)、化学合成并化学修饰的miR-125b反义核酸(anti—miR-125b)或者阴性对照(Negative control)转染至MG-63和Saos-2细胞内。收集细胞后提取总蛋白,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测STAT3蛋白表达水平。结果：1.STAT3为miR-125b的靶基因,miR-125b通过结合3’UTR区抑制靶基因STAT3的表达。2.miR-125b浓度依赖性的调节细胞增殖,过表达miR-125b能抑制Saos-2细胞增殖,抑制STAT3蛋白表达量。3.转染miR-125b模拟物的骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表达量降低。4.转染miR-125b反义核酸的骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表达量升高。结论：STAT3是miR-125b的靶基因,miR-125b通过结合STAT3的3’UTR区抑制靶基因STAT3的表达。第三节STAT3对miR-125b的转录激活作用目的：探讨STAT3作为重要的转录因子能否转录激活miR-125b。方法：1.我们首先采取CONSITE和PromoterInspector软件分析预测成熟miR-125b在人基因组上的两个基因位点上游的10kb序列,分别是11号染色体上的miR-125b-1,21号染色体上的miR-125b-2。找到潜在的启动子区域。2.构建荧光素酶表达载体将miR-125b-1前体5’端不同长度片段(-1600to-900bp,-1400to-900bp,-1175to-900bp)序列克隆至PGL3载体。再转染到骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中,转染48小时后收取细胞,本实验采取双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参,检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。3.我们选用MatInspector软件对启动子区域的顺式作用元件进行分析,找出可能存在的转录因子结合位点。4.采取点突变的办法使-1175to-900bp序列中潜在的STAT3结合序列、STAT6结合序列和CAAT序列发生碱基突变,构成PGL3-mSTAT3,PGL3-mSTAT6和PGL3-mCAAT突变荧光素酶报告基因质粒。转染到骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中,转染48小时后收取细胞,本实验采取双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参,检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。5.我们通过凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)来进一步鉴定STAT3蛋白和miR-125b前体上与STAT3蛋白相结合序列之间的相互作用,首先人工合成STAT3-wt、STAT3-consensus、 STAT3-mut、 STAT6-wt寡核苷酸序列探针,其中STAT3-consensus为STAT3所识别的共有序列作为实验中的阳性对照,再将其中的STAT3-wt和STAT3-consensus用32P同位素标记上,根据不同的探针组合、STAT3抗体与MG-63细胞核蛋白提取物共孵育,最后根据DNA-蛋白复合物的位置、特点和强度来判断特异性结合。结果：1.通过CONSITE和PromoterInspector软件我们发现miR-125b-1有一个RNA聚合酶II核心启动子位于miR-125b前体序列上游-1600to-900bp。2.分析不同片段的荧光素酶活性,我们确定核心启动子序列位于-1175to-900bp区域。3.通过MatInspector软件分析,我们预测在其核心启动子区域具有CAAT元件,两个STAT3结合位点,一个STAT6结合位点。4.突变体荧光素酶报告基因实验发现CAAT元件和STAT3位点发生点突变后,荧光素酶活性显著下降。而STAT6位点突变后,荧光素酶活性无明显变化。5.EMSA蛋白一DNA结合实验发现,[32p]-STAT3-wt探针和MG-63细胞核蛋白提取物孵育后能被检测到DNA-蛋白复合物的形成。作为阳性对照的[32p]-STAT3-consensus同样被检测到形成DNA-蛋白复合物并且迁移到同一个位置。其次,[32p]-STAT3-wt探针一蛋白复合物的形成能明显被STAT3-consensus、未标记探针和STAT3抗体竞争抑制,而不会被碱基序列突变的探针竞争抑制。结论：STAT3蛋白能结合到miR-125b前体序列的核心启动区转录激活miR-125b。第四节骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域甲基化状态目的：探讨骨肉瘤细胞中miR-125b启动子区域的DNA甲基化状态。方法：选用骨肉瘤细胞系MG-63和Saos-2,使用去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine处理细胞后,观察其对细胞增殖和细胞内miR-125b表达水平的影响。同时通过试剂盒提取MG-63和Saos-2中的DNA,再经过亚硫酸氢钠的处理,最后通过甲基化特异性PCR检测miR-125b启动子区域的DNA甲基化状态。结果：1.随着去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine浓度的提高,细胞的增殖受到明显的抑制作用。2.随着去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine浓度的提高,miR-125b表达水平明显升高。3.甲基化特异性PCR检测骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域的甲基化水平升高。结论：骨肉瘤细胞中miR-125b表达水平的降低可能与miR-125b启动子区域DNA的高甲基化相关。第二部分血清microRNA作为骨肉瘤生物标记物的研究目的：筛选出骨肉瘤病人血清标本中差异表达的microRNA,研究其作为诊断骨肉瘤血清标记物的潜能。方法：采用microRNA PCR芯片筛选骨肉瘤患者和正常对照组血清microRNA表达谱,选择差异表达的血清microRNA。将筛选出来的候选microRNA进一步用qRT-PCR在20例肿瘤标本和20例正常对照组验证,ROC分析用来评价其诊断性能。结果：首先通过芯片筛选出来14个候选microRNA,在此基础上,扩大标本量验证,得7个差异表达的血清microRNA(miR-106a-5p, miR16-5p, miR-20a-5p, miR-425-5p, miR451a, miR-25-3P, miR139-5p),AUC分别是0.7255(95%CI0.5435-0.9075),0.7686(95%CI0.6067-0.9306),0.8471(95%CI0.7155-0.9786),0.7961(95%CI0.6438-0.9484),0.7765(95%CI0.6163-0.9366),0.7961(95%0.6420-0.9501)和0.7098(95%0.5308-0.8888)。结论：骨肉瘤中的血清microRNA存在差异表达谱,且有潜力成为骨肉瘤诊断和预测分子标记物。