柑橘精油纳米乳制备表征及其对金黄色葡萄球菌抗菌活性研究

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柑橘精油是从柑橘果皮中提取出来的一种次生代谢产物,具有广谱的抑菌抗菌效果,然而柑橘精油的性质不稳定,易挥发、氧化,且难溶于水,不易运用于实际生产生活。将柑橘精油制备成纳米乳液不仅能克服精油的缺点,还能提高精油的抗菌活性,有一定现实意义。金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性细菌,能造成食物的腐败变质,引起食物中毒,开发柑橘精油纳米乳能提高柑橘果皮副产物的高值化利用,可作为传统抗菌剂的替代剂,具备广阔的应用前景。本研究从以10种常见柑橘为原料,提取精油,筛选出对金黄色葡萄球菌具有良好抗菌效果的柑橘精油制备纳米乳,并对纳米乳液稳定性和抗菌活性进行综合评估,主要研究结果如下:1.通过抑菌圈试验发现10种柑橘精油对金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌效果,筛选抑菌效果较好的柠檬(15.80±0.30 mm)、蜜柚(14.66±0.89 mm)、甜橙(14.65±0.70mm)3种精油进行后续试验,气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)测定表明3种柑橘精油的主要成分为D-柠檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、β-蒎烯等物质,这些物质普遍具有良好的抑菌效果。纳米乳液制备试验表明,当表面活性剂与油相质量比(surfactant-to-oil rate,SOR)为9:1、8:2、6:4、5:5时3种柑橘精油均存在相转变点,可形成纳米乳液体系,通过丁达尔效应初步判断形成的乳液粒径分布在1-100nm之间,苏丹III染色试验可判断乳液类型为水包油型。2.纳米乳的平均粒径与多分散相系数(Polymer dispersity index,PDI)试验结果表明当SOR值为8:2时,3种柑橘精油纳米乳液有最大载油量,平均粒径分别为柠檬14.93±0.53 nm,甜橙15.29±0.57 nm,蜜柚16.39±0.48 nm,PDI值分别为柠檬0.244±0.031、甜橙0.314±0.028、蜜柚0.353±0.024,此时的纳米乳液粒度分布均匀、稳定性高。因此将3种纳米乳液的配方统一设定为精油6%、吐温80 24%、水70%。纳米乳液的缓释试验表明,在持续高温(100℃)环境下,3种柑橘精油纳米乳液的挥发率均显著低于其他两个对照组,说明纳米乳液有缓释效果。纳米乳液贮存试验表明:3种纳米乳液在各温度(4℃,25℃,40℃)贮藏14 d期间均保持体系稳定,样品保留率降低程度均低于同处理下的对照组,说明制备的纳米乳液具有良好的热稳定性;3种纳米乳液在光照条件下连续贮藏14 d后的样品保留率与避光保存的样品保留率无显著性差异,说明制备的纳米乳液具有良好的光稳定性。3.纳米乳液的抗菌活性试验表明,相比纯精油,3种柑橘精油纳米乳液的抑菌圈直径均显著增大,最低抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)与最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)均变小,说明制备纳米乳液提高了精油的抗菌活性,其中柠檬精油纳米乳液的抗菌效果提升最明显,MIC、MBC值为1.875 mg/m L,约为纯精油的4倍。扫描电镜试验观察到经柠檬精油纳米乳液处理的金黄色葡萄球菌菌体变得扭曲、变形、黏连,菌体表面变得粗糙,细胞膜遭到严重损害,说明纳米乳液相比纯精油对金黄色葡萄球菌形态的破坏程度更大,对细胞膜具有更强的损伤作用。透射电镜试验观察到纳米乳液处理组的细胞存在中空和孔洞,细胞壁节段性或完全消失,产生大量的细胞破碎物,细胞质变得不均匀,表明纳米乳液可能破坏金黄色葡萄球菌细胞壁结构、导致细胞壁的溶解和缺失,从而影响细胞膜的通透性,造成胞内物质泄漏。细胞膜通透性试验和胞内物质释放试验表明,纳米乳液可能与细胞膜密切结合,改变细胞膜通透性,使得细胞内环境稳态遭到破坏,导致细胞中核酸、蛋白质、K+等胞内物质大量泄漏,致使细菌死亡。
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