【摘 要】
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本实验主要通过对TNF家族成员RANKL与其受体RANK在分子水平及细胞水平亲和力不同的分析,来说明RANKL与细胞结合的亲和力更具有生理水平上的意义。其中RANKL是TNF家族成员,RAN
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本实验主要通过对TNF家族成员RANKL与其受体RANK在分子水平及细胞水平亲和力不同的分析,来说明RANKL与细胞结合的亲和力更具有生理水平上的意义。其中RANKL是TNF家族成员,RANK是其受体。两者通过相互作用,在骨重建、风湿性关节炎、骨转移、乳腺发生过程中起重要作用。首先通过基因工程技术将小鼠的RANKL、RANK基因克隆到原核表达载体上,再转化到大肠杆菌E.coli中,诱导使其表达目的蛋白,并通过亲和层析,快速蛋白液相层析(FPLC)以及蛋白复性的方法纯化出有活性的目的蛋白,再运用FPLC和蛋白交联方法观察RANKL、RANK蛋白在溶液中的多聚状态,接着通过pull-down实验和蛋白迁移实验证明了RANKL、RANK蛋白是相互结合的,RAW264.7细胞分化阻断实验则证明RNAKL蛋白具有生物功能,最后通过表面等离子共振(SPR)技术分析RANKL与RANK蛋白实时结合过程,测定两者的亲和解离常数KD为1.09e-10M,再通过ATTANA CELL 200分析RANKL与Raw264.7细胞膜上的RANK蛋白之间的相互作用,测定亲和解离常数KD为1.8e-8M。这是第一次在生理水平分析蛋白与细胞上受体的亲和力,更具有真实性和研究意义。
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