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研究背景 肝细胞癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。就全球而言，肝癌的发病率在各种癌症中居第8位，其中男性第6位，女性第11位，而在发展中国家，肝癌的发病率在各种癌症中居第3位。肝癌的发生有地区差异性，中国是肝癌的高发区之一，死亡率占全球肝癌的40～45％。1990年～1992年对我国27个省(市、自治区)居民恶性肿瘤死亡分析的抽样调查表明，胃癌的死亡率占所有肿瘤的第一位，肝癌死亡人数占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8％，居第二位，但在30岁～40岁年龄段居各种肿瘤之首。临床上出现症状的肝癌患者往往已属中晚期，且由于大多数肝癌患者具有肝硬化的基础，使得临床疗效较差。目前在肝癌诊断中使用最广泛也是最理想的标志物依然是甲胎蛋白，然而甲胎蛋白在肝癌诊断中的价值也有限。大约有30％～40％的肝癌病人血中甲胎蛋白值在正常范围内；即使甲胎蛋白检查阳性的患者，还必须与肝炎、肝硬化的活动期等疾病相鉴别。这就为临床的诊断工作带来了一定的难度，因此进一步开展新的肝癌早期诊断和治疗方法的研究有重要的意义。现代分子生物学研究表明，肿瘤的发生与基因的突变或异常表达有着密切的联系。目前已经对肿瘤发生发展的遗传学机制进行了多方面的研究，但我们对肝癌发生的分子机制仍不完全明了。为了进一步寻找与肝细胞癌发生发展相关的基因，从而为更深郑州大学2002年硕士毕业论文 消减。＊＊A片段PP 2和＊ 在肝细胞癌组织中差异表达的分析入地研究其发生机制、开展早期诊断并进行相关的基因治疗打下坚实的遗传学基础，消化疾病研究所的朱武凌博士运用抑制性消减杂交的方法，构建了肝细胞癌消减CDNA文库并获得了93个克隆。对这些克隆进行必要的筛选并对其在肝细胞癌组织中的差异表达进行分析，是进行下一步工作的基础。 研究目的1、使用RNA印迹杂交的方法，对构建消减CDNA文库时所用的肝硬化和肝细胞癌组织中 P 02和 P 55 InRNA的实际表达情况进行分析，排除消减杂交过程中可能出现的假阳性结果；2、使用逆转录 PCR和计算机图像分析的方法，对来自 10例肝细胞癌患者术中切除的肝硬化和肝细胞癌组织中 P 02和 P 5 5 mRNA的表达情况进行检测，并使用t－检验的方法对结果进行统计学处理，分析 P 02和 P 5 5 m伽A在肝硬化和肝细胞癌组织中表达的差别及其统计学意义；3、通过在GenBank数据库中进行的同源性检索和相关分析，初步椎测 P 02和 P 5 5在肝细胞癌发生发展过程中可能的作用，为随后对其全长基因的功能进行更深入的研究作准备。 研究方法1、采用一步热酚法抽提组织总KN－x，使用HRP标记的CDNA探针和增强化学发光检测法进行RNA印迹杂交以筛选阳性克隆；2、使用逆转录 PCR和计算机图像分析方法对 P02和 P 5 5 M在肝细胞癌组织中的差异表达进行分析，用 t检验对分析结果进行统计学处理；3、通过Gechank数据库进行同源性检索和相关分析。 研究结果l、通过对RNA印迹杂交结果的分析，发现CDNA探针P 02与肝硬化和肝细胞癌组织总RNA的杂交信号强度的表达值分别为37299．5771和 148455．8521，CDNA探针P55与肝硬化和肝细胞癌组织总RNA的杂交信号强度的表达值分别为1792．8770和 2014．8179。2、通过对逆转录PCR产物电泳图像的分析及统计学处理，发现肝硬化和肝细胞癌组织总 KNA中，P02 IllltrvA逆转 －二－郑州大学200二年硕士毕业论文 消减。DN A片段P 02和卜55在肝细胞癌组织中差异表达的分析录PCR产物量的表达值分别为 l．4416f0．2150和 0．523020士0．1647，h者相比差异有显著性（P、0刀5人 在肝硬化和肝细胞癌组织中 P 55 nnuuA的表达值分别为 0．5176士0．2219和0．8329士0．27，h者相卜差异有显著性（P＜0．05）。3、在 Ge俯毗核酸数据库中的同源性检索及相关分析表明，P 02与人翻译控制肿瘤蛋白高度同源，P 55未发现有匹配的己知基因。4、在GenBank人类基因组数据库中的同源性检索表明，P 02 位于人类基因组13ql3－q14，P55位于人类基因组6q24－q25。 研究结论 1、使用 RNA印迹杂交的方法，确定克隆P02和P 55是肝细胞癌相关的差异表达基因的表达序列标签。2、通过对来自10例肝细胞癌患者术中切除的肝硬化和肝细胞癌组织中PJ2和 P 5 5 mRNA的逆转录 PCR分析及统计学处理，确定 PJ2和 PS 5mRNA高表达于肝细胞癌组织。3、通过同源性检索发现P＊2mRNA与翻译控制肿瘤蛋白高度同源，并初步确定P02基因位于13q13－ql4。4、通过同源性分析，初步确定P．55是一个位于6q24q25的未知基因。5、同源性分析结果提示PJ2在HCC发生发展的过程中，与细胞维持自身生存状态和免疫抵抗有关，并有可能参与了细胞的增殖过程。