酿酒酵母是一种安全无毒,无致病性的真核生物,其培养条件简单,有较清楚的遗传背景,容易进行基因操作,被用作研究真核生物的模式生物。酿酒酵母表达外源基因有一定的翻译后加工能力,能使外源蛋白质具有一定程度的折叠加工和糖基化修饰,适合于表达真核生物基因以及制备有生物活性的表达蛋白。胞内表达抗原蛋白的酿酒酵母作为疫苗,通过皮下注射免疫人和动物,能获得强有力的特异性的免疫应答。酿酒酵母特殊的细胞壁结构使其对消化道的胃酸有较强的抵抗作用,因而能作为一种天然的生物胶囊为生物大分子提供良好的保护,此外酿酒酵母细胞壁所含成分可调节肠胃功能。酿酒酵母的颗粒结构,使其能专一而有效的向抗原呈递细胞传递目的抗原。酿酒酵母细胞壁结构和成分,使其具有强大的免疫佐剂活性,使抗原呈递细胞上调免疫激活所必须的三种信号。以酿酒酵母为载体胞内表达目的抗原蛋白的疫苗,由于其生产成本低,具有非常大的运用潜力和经济价值。但是由于不同的目的抗原蛋白的特性,使得酿酒酵母胞内表达抗原蛋白在很多情况下,由于非理想的翻译后修饰和低水平的表达产量而受到限制。酿酒酵母附加体质粒是独立于基因组外的DNA片段,目前对其基因操作的技术已经很成熟。为研究酵母作为载体在核酸疫苗以及口服基因治疗作用,需要一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞中表达的穿梭载体。本实验将构建好的含目的基因由CMV启动子控制的酿酒酵母附加体质粒转入酿酒酵母中。CMV启动子能在哺乳动物细胞中发挥转录功能,而且在哺乳动物细胞中能使目的基因表达得到正确的折叠与修饰,起到更好的免疫效果。本研究工作如下：1,以HA和eGFP作为目的蛋白,将其编码序列克隆至CMV控制基因表达,使其存在于酿酒酵母附加体载体上,得到重组附加体质粒载体。2,通过常规的氯化锂法将携带目的基因的附加体质粒转入酿酒酵母INVSc1的感受态细胞中,通过营养缺陷型的筛选挑选转化子。3,抽取酿酒酵母总DNA,并通过PCR鉴定挑选正确的转化子。4,以脂质体介导的方式将携带目的基因的载体转入Hela细胞中,观察并检测其表达情况,证明构建好的附加体质粒在哺乳动物细胞中能够正确的启动表达目的蛋白。5,扩大培养验证正确的转化子,收集并破碎酵母细胞通过western blotting的方式检测目的蛋白在酿酒酵母中的表达情况,验证CMV启动子是否在酿酒酵母中启动表达。6,并通过共培养的方式,让小鼠吞噬细胞RAW1吞噬灭活的携带目的基因附加体质粒的酿酒酵母,以观察并检测目的蛋白能否在被巨噬细胞吞噬后启动表达。7,通过皮下注射方式接种小鼠,三次免疫后眼眶取血,通过ELISA检测其是否有相关抗体表达,来验证其免疫效果。8,以致死剂量的H1N1病毒对小鼠进行攻毒实验,观察并记录小鼠的存活情况,来验证免疫效果。本实验最终转化并挑选了稳定遗传的携带目的基因片段附加体质粒的酿酒酵母,确定携带目的基因的附加体载体能在哺乳动物细胞中表达。通过皮下注射灭活的携带附加体质粒的酿酒酵母免疫小鼠证实其有一定的免疫作用。为酿酒酵母作为核酸疫苗以及口服疫苗的研究打下一定的基础,为以后口服疫苗的研究做出了贡献。但从免疫试验结果来看,免疫效果还不太理想,后续将在进一步改造载体使其能在普通培养基上生长而不至于附加体质粒消退,同时尝试提高附加体质粒的拷贝数和改变接种方式,使其免疫效果更加明显。以及尝试以口服的形式检测其免疫效果。