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一、研究目的探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)对秀丽线虫有丝分裂区生殖细胞增殖能力、减数分裂区生殖细胞分化能力的影响及其毒性作用机制。二、方法1、观察后代数目、世代时间、瞬时产卵量以及子宫内受精卵的数目等生殖毒性指标;并通过DAPI染色观察秀丽线虫总生殖细胞数、有丝分裂区生殖细胞数以及减数分裂区生殖细胞数的变化,评价DEHP对秀丽线虫生殖能力的影响。2、DAPI染色下观察有丝分裂区细胞数以及细胞核的大小判断有丝分裂区生殖细胞是否发生增殖阻滞;荧光显微镜下观察JK2868[LAG-2::GFP]虫株DTC细胞的荧光强度,以及WS1433[HUS-1::GFP]虫株中生殖细胞的DNA损伤情况,分别研究DEHP对DTC细胞的影响以及对生殖细胞DNA损伤的影响;通过RT-qPCR测定DNA损伤相关基因以及ATM-1/ATL-1介导的DNA损伤通路中相关基因mRNA的表达水平,利用相关基因敲除突变体WS2277/hus-1(op241),VC381/atm-1(gk186),VC728/atl-1(ok1063),WS3455/chk-2(gk212),JR1279/cep-1(w40),RB2075/phg-1(ok2741)进一步对ATM-1/ATL-1通路进行验证。3、荧光显微镜下观察JH2623(RAD-51::GFP)虫株减数分裂区DNA损伤修复情况;DAPI染色下观察过渡区生殖细胞数,并在荧光显微镜下观察JH2120(HIM-3::GFP)虫株减数分裂区生殖细胞中HIM-3蛋白的表达水平,倒置显微镜下观察后代雄虫率;DAPI染色下观察粗线期生殖细胞数并在微分干涉差显微镜(DIC)下测量-2期卵细胞横轴的大小,评定DEHP对终变期生殖细胞的影响;通过RT-qPCR测定减数分裂中DNA损伤与修复相关基因的mRNA表达水平。三、结果1、DEHP对秀丽线虫生殖能力的影响与对照组相比,各个染毒剂量的DEHP均可导致秀丽线虫后代数目显著减少;在1.0和10.0 mg/L暴露剂量下,秀丽线虫瞬时产卵量显著下降并伴随着子宫内受精卵数目明显降低,与对照组相比差异具有统计学意义;世代时间只在10.0 mg/L的剂量组中有所延长。通过DAPI染色进一步研究生殖细胞发现,与对照组相比,1.0和10.0 mg/L的暴露剂量下,总生殖细胞数、有丝分裂区和减数分裂区的生殖细胞数均显著下降。2、DEHP致有丝分裂区细胞数目减少的机制研究DEHP染毒后,与对照组相比,秀丽线虫有丝分裂区生殖细胞数在0.1、1.0和10.0mg/L剂量组下显著减少,差异具有统计学意义,且高剂量的DEHP暴露后,会导致有丝分裂区生殖细胞核异常增大;而JK2868虫株中DTC的荧光强度和对照组相比并无统计学差异。WS1433[HUS-1::GFP]虫株生殖细胞中发生DNA损伤的细胞数目随着暴露剂量的升高而增加,差异具有统计学意义。DNA损伤相关基因hus-1,clk-2 and cep-1的mRNA表达量显著升高,同时ATM-1/ATL-1通路中atm-1,atl-1,chk-2,and phg-1的基因表达量也升高;通过将相关基因敲除后,发现与野生型秀丽线虫相比,基因敲除突变体WS2277/hus-1(op241),VC381/atm-1(gk186),VC728/atl-1(ok1063),WS3455/chk-2(gk212),JR1279/cep-1(w40),RB2075/phg-1(ok2741)经DEHP染毒后,有丝分裂区的生殖细胞数有所回升。3、DEHP致减数分裂区生殖细胞减少的机制研究与对照组相比,在1.0和10.0 mg/L暴露剂量下,DEHP可导致减数分裂区细胞数显著下降,差异具有统计学意义;通过观察JH2623[RAD-51::GFP]虫株中减数分裂区DNA损伤的修复情况,发现在1.0和10.0 mg/L剂量下,RAD-51蛋白的表达量升高,减数分裂区生殖细胞DNA损伤修复增加,差异具有统计学意义;过渡期生殖细胞数在1.0和10.0 mg/L剂量下显著下降,但DEHP并未影响同源染色体的配对情况;与对照组相比,终变期生殖细胞数在1.0和10.0 mg/L剂量组下显著减少,且-2期卵母细胞的横轴长度在0.1、1.0和10.0 mg/L剂量下明显降低,差异具有统计学意义。在0.1、1.0和10.0 mg/L暴露剂量下,rad-54,spo-11,pch-2,rad-51,mre-11,and msh-5基因的表达量均上升,差异具有统计学意义。说明,DEHP诱导减数分裂区发生了DNA损伤且出现DNA损伤修复异常。四、结论DEHP通过诱导DNA损伤激活ATM-1/ATL-1介导的下游DNA损伤通路导致有丝分裂区发生增殖阻滞,导致有丝分裂区生殖细胞数目减少;影响减数分裂区DNA损伤修复并激活rad-54,spo-11,pch-2,rad-51,mre-11 and msh-5等基因的表达,诱导减数分裂区发生DNA损伤,导致减数分裂区生殖细胞数目减少,最终导致总生殖细胞数目减少,使秀丽线虫生殖能力下降来发挥其生殖毒性作用。