研究背景与目的:失血性休克（hemorrhagic shock,HS）是低血容量休克的一种形式,短时间内快速而严重的失血会引起有效循环血量锐减,导致重要脏器组织微循环灌注不足及细胞水平输氧障碍,若救治不及时,最终发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）或多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF）,甚至死亡。肝脏是HS早期易受损靶器官,肝脏功能障碍将进一步加快病程进展、加重病情。各种原因所引起的损伤导致在诸多类型细胞中触发细胞内Ca²⁺超载,Ca²⁺不仅可作为一个独立因子产生损伤作用,其它许多因子的损伤作用最终亦可通过它来完成。早期对HS肝脏功能进行准确的评估,有利于指导相关临床治疗、评估治疗效果及判断预后。由于血清学检查及常规影像学对HS早期肝功能障碍程度的评估均存在局限,因此亟待一种新的方法用于早期、活体、无创性评估HS肝脏功能。目前,细胞内Ca²⁺超载的检测方法多种多样,但绝大部分检测方法仅应用于实验研究且属于有创操作;此外,这些方法均不能同时检测多器官损伤细胞内Ca²⁺超载的程度。磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）具有很高的空间及软组织分辨率,并已广泛用于临床工作及科学研究之中。Mn²⁺与Ca²⁺具有相似的理化特性,Lauterbur首次提出一种MRI新技术,即锰增强磁共振成像（manganese-enhanced magnetic resonance imaging,MEMRI）,目前多用于中枢神经系统解剖与功能、心肌缺血相关领域研究。基于Mn²⁺良好的生物学特性,Mn²⁺模拟Ca²⁺MRI离子示踪是目前最有可能在临床上实现活体早期检测脏器损伤细胞内Ca²⁺超载的一种新技术。本研究主要目的是建立不同时间点HS大鼠模型,利用MEMRI技术获得肝脏纵向弛豫率变化量（δR1）,并结合肝组织Mn²⁺含量变化量(δMn²⁺)及病理学结果,用以评估肝脏细胞内Ca²⁺超载及肝脏损伤程度,为定量评估肝脏功能提供无创性检测方法及可靠的影像学依据。研究方法:第一部分适于大鼠肝脏MEMRI的最佳MnCl₂输注剂量及扫描延迟时间1.选取无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级健康雄性斯泼雷格·多雷（sprague dawley,SD）大鼠,采用腹主动脉采血的方法制备新鲜SD大鼠血清,用于配制含不同Mn²⁺浓度的SD大鼠血清样本。2.配制目标浓度为10mmol/L的MnCl₂溶液及含不同Mn²⁺浓度的大鼠血清及生理盐水样本,各组样本中8种不同Mn²⁺浓度梯度依次为0⁰.8mmol/L。3.采用7.0-T小动物MRI仪分次对大鼠血清及生理盐水样本进行扫描,获得样本的纵向弛豫时间加权成像（T1-weighted imaging,T1WI）及纵向弛豫时间定量影像（T1-mapping）,测量每个样本的T1值,再拟合得到大鼠血清及生理盐水样本中Mn²⁺浓度-MRI T1值及Mn²⁺浓度-纵向弛豫率关系图。4.分析并比较不同Mn²⁺浓度的大鼠血清和生理盐水样本T1WI信号强度、Mn²⁺浓度-MRI T1值及Mn²⁺浓度-纵向弛豫率的变化,进一步探讨Mn²⁺与大鼠血清内蛋白质的相互作用。5.对SD大鼠分别注射不同剂量MnCl₂溶液,采用7.0-T小动物MRI仪于不同扫描延迟时间行T1-mapping成像,并定量测量T1值,获得肝脏Mn²⁺剂量-纵向弛豫率变化量（δR1）曲线图和Mn²⁺-时间清除曲线图。第二部分MEMRI评估失血性休克大鼠不同时间点肝细胞内Ca²⁺的变化1.SD大鼠经禁食不禁水12小时处理后,采用颈总动脉置管,快速放血的方法,建立失血性休克不同时间点大鼠模型。2.采用7.0-T小动物磁共振成像仪于MnCl₂注射前对SD大鼠上腹部进行T1-mapping扫描,测得肝脏基线T1值;经SD大鼠颈外静脉注射MnCl₂后,再次进行T1-mapping扫描,测得肝脏增强T1值,计算可得肝脏纵向弛豫率变化量（δR1）。3.MRI扫描结束后,立即经心脏灌注固定获得SD大鼠肝组织,一部分肝组织用于电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）测量肝组织内Mn²⁺含量,另一部分肝组织用于病理学检测。4.参照病理学结果,结合肝脏纵向弛豫率变化量（δR1）及对应Mn²⁺含量变化量(δMn²⁺),评价肝细胞内Ca²⁺超载及肝损伤程度。研究结果:第一部分适于大鼠肝脏MEMRI的最佳MnCl₂输注剂量及扫描延迟时间1.Mn²⁺浓度为0时,生理盐水呈低信号,大鼠血清呈中等信号;随着Mn²⁺浓度的升高,生理盐水和大鼠血清的T1WI信号均逐渐增高,大鼠血清的T1WI信号上升更快。2.含相同Mn²⁺浓度的大鼠血清与生理盐水间,大鼠血清的T1值均小于生理盐水（P均<0.001）。大鼠血清和生理盐水中,不同Mn²⁺浓度样本间T1值差异均有统计学意义（P均<0.001）,随着Mn²⁺浓度增大,T1值均逐渐减小,且任何两个不同浓度样本间T1值差异均有统计学意义（P均<0.001）。3.大鼠血清及生理盐水中,Mn²⁺浓度与弛豫率呈近似线性关系。随着Mn²⁺浓度的增加,相应样本的弛豫率亦呈近似线性趋势增加。当环境温度22℃时,Mn²⁺在大鼠血清中的r为5.068mmol^-1s^-1,明显大于Mn²⁺在生理盐水中的r(3.863mmol^-1s^-1)。4.含不同Mn²⁺浓度的大鼠血清样本,相对于生理盐水,不同大鼠血清样本的弛豫率增强系数（ε^*）均大于1。5.SD大鼠肝脏7.0-T MEMRI扫描MnCl₂最佳输注剂量为10?mol/kg BW,最佳扫描延迟时间为5min。第二部分MEMRI评估失血性休克大鼠不同时间点肝细胞内Ca²⁺的变化1.采用MEMRI及T1-mapping对失血性休克大鼠不同时间点肝脏T1值测量,各组输注MnCl₂溶液前,肝脏T1值未见明显差异（F=0.107,P=0.99）。随着失血性休克时间的延长,各组SD大鼠肝脏T1-mapping图颜色逐渐加深,肝脏T1值逐渐减小,各组大鼠肝脏T1值均有统计学差异（F=1156.102,P<0.001）。2.利用ICP-MS测得失血性休克大鼠不同时间点肝脏Mn²⁺含量,随着失血性休克时间的延长,肝脏Mn²⁺含量逐渐增加,各组间Mn²⁺含量差异具有统计学差异（F=68.332,P<0.001）。3.在失血性休克不同时间点大鼠中,随着休克时间的延长,大鼠肝脏纵向弛豫率改变量δR1及所对应肝脏Mn²⁺含量变化量δMn²⁺均呈增加趋势,经Pearson相关分析可得δR1与δMn²⁺呈线性正相关,相关性极强（r=0.958,P<0.001）。4.病理学结果显示,对照组、假手术组及HS-0min组均未见肝组织明显异常改变,随着休克时间的延长,HS-30min组、HS-60min组及HS-90min组肝组织出现不同程度肝小叶结构稍紊乱、肝窦闭塞及狭窄、肝细胞水肿样变性、空泡形成及间质炎细胞浸润,损伤程度逐渐加重。研究结论:1.Mn²⁺可缩短大鼠血清及生理盐水介质的T1值,且Mn²⁺浓度与纵向弛豫率呈线性关系。Mn²⁺在大鼠血清中的纵向驰豫效能明显大于生理盐水,Mn²⁺与血清中生物大分子（如白蛋白等）相互作用,能够引起生物大分子周围氢质子纵向弛豫时间明显缩短。2.采用7.0-T小动物MRI仪对SD大鼠进行肝脏MEMRI扫描时,MnCl₂最佳输注剂量为10?mol/kg BW,最佳扫描延迟时间为5min。3.随着大鼠失血性休克时间的延长,肝脏T1值逐渐减小,其Mn²⁺含量逐渐增高,肝脏纵向弛豫率的变化量δR1及所对应肝脏含Mn²⁺变化量δMn²⁺两者之间具有很强的相关性,故δR1可作为评价失血性休克肝细胞Ca²⁺超载程度的定量指标。4.结合常规影像学、ICP-MS及组织病理学结果综合分析可知,MEMRI比常规病理学检查能更早发现肝损伤的证据,Mn²⁺模拟Ca²⁺MRI离子示踪能够实现活体早期检测脏器损伤细胞内Ca²⁺超载。