背景:内皮细胞在调节血管功能,生理和病理过程中起重要的作用,血管内皮细胞(VEC)的氧化应激损伤(OSI)是导致人体动脉粥样硬化、继发性高血压和2型糖尿病等疾病的重要原因,因此有效的管理内皮氧化应激损伤在心血管疾病的治疗中具有重要的临床意义。然而,由于OSI涉及许多细胞因子和信号传导途径,因此目前尚不清楚OSI的病理生理学机制。PI3K/Akt信号通路是广泛存在于组织细胞间的一种信号传导通路,可以调控细胞间的信号联系、细胞质内的信号转导以及细胞核中的基因转录。此外,PI3K/Akt通路还在细胞增殖,迁移,生长,分化和死亡等活动中发挥了极其重要的作用,是一种高度保守的的信号传导通路。龙胆苦苷(Gentiopicroside,GPS)属于裂环环烯醚萜苷类化合物,其分子式是C16H2009。GPS是龙胆类植物发挥药效的主要有效成分。大量的临床及实验研究发现:GPS不仅有抗炎止痛、保肝利胆、促进胃肠动力和抗病毒等作用,更具有抗氧化损伤,抑制大动脉平滑肌细胞的增殖扩散等对心血管系统的保护作用,尤其在动脉粥样硬化等疾病中具有显著的效果。然而,GPS对血管内皮细胞的氧化应激损伤是否有保护作用却罕有报道,尚需进一步研究。目的:既往的研究发现内皮功能障碍往往在心血管疾病发病之前已经发生改变,其中,氧化应激在内皮功能障碍的发病机制中起着重要作用。本研究,通过过氧化氢(H2O2)模拟细胞的氧化应激损伤,探讨龙胆苦苷(GPS)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激损伤的保护作用及其在损伤治疗中的可能机制研究。方法:实验一:首先应用不同浓度得H2O2(100、200、400 μmol/L)处理人脐静脉内皮细胞2、4、8 h,目的是检测H2O2的毒性梯度范围,并建立合适的氧化应激损伤细胞模型。我们用H2O2的干扰来研究加入GPS的人脐静脉内皮细胞在氧化应激损伤中的存活率、凋亡率及迁移率等指标。把体外培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为Control组、H2O2组、H2O2+740Y-P组及740Y-P组。H2O2组用浓度为400 μmol/L的H2O2培养液处理内皮细胞;H2O2+740Y-P组在用400 μ mol/L浓度H2O2的培养液处理前2h加入500 mg/mL的740Y-P溶液处理HUVECs;740Y-P组只在培养基中加入500 mg/mL的740Y-P溶液。各组细胞均在37 ℃的恒定温度,5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养6小时。细胞经过上述处理后,用MTT法和TUNEL法分别检测细胞存活率和细胞凋亡率,用划痕实验检测血管内皮细胞的迁移率。实验二:将龙胆苦苷(GPS)用DMSO预溶,并用细胞培养液稀释至相应浓度,首先应用不同浓度得GPS(10、20、40 μmol/L)处理人脐静脉内皮细胞4h,目的是检测GPS是否存在毒性梯度范围,探讨GPS是否有细胞毒性作用,并建立合适的氧化应激损伤细胞模型。取一组细胞并将内皮细胞分为4组,分别为Control组、H2O2组、GPS+H2O2组及GPS组。Control组不做任何处理,用无血清的DMSO(0.01%)培养液培养;H2O2组用400 μmol/L浓度H2O2的培养液处理进行干扰;GPS+H2O2组用400μ mol/L浓度H2O2的培养液处理的同时加入1 mol/L的GPS;GPS组仅在Control组的基础上加入1 mol/L的GPS。各组细胞均在37℃的恒定温度下及5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养6小时。经过上述处理后,用MTT法和TUNEL法分别检测细胞存活率和细胞凋亡率,用划痕实验检测血管内皮细胞的迁移率。使用专业试剂检测盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量、GSH-Px和MDA的含量,West-blot检测各组细胞各蛋白Bcl-2、Caspase3、Bax、cytochrome C的表达水平的变化。实验三:将细胞按1 × 108/L均匀接种在96孔板内,首先将HUVECs细胞分为2组:Control组细胞加入siRNA处理,用无血清的DMSO(0.01%)培养液培养,PI3K siRNA组在Control组的基础上加入1mol/L的PI3K蛋白分子。2组细胞均在37℃的恒定温度下及5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养4小时,观察SOD、GSH-Px和MDA含量变化和PI3K活性变化,探讨PI3K/Akt信号通路在信号传导中是否发挥作用。再取一组细胞并将细胞分为3组,分别为H2O2组、GPS+H2O2组及GPS+H2O2+PI3K siRNA组。H2O2组用400 μ mol/L浓度H2O2的培养液处理进行干扰;GPS+H2O2组用400 μmol/L浓度H2O2的培养液处理的同时加入1 mol/L的GPS;GPS+H2O2+PI3K siRNA 组在 GPS+H2O2 组的基础上加入 1 mol/L 的 PI3K siRNA。各组细胞均在37℃的恒定温度下及5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养6小时。各组细胞经过上述处理后,免疫荧光和West-blot检测各组细胞各蛋白Bcl-2、Caspase3、Bax以及cytochrome C的表达水平的变化。结果:实验一,经过H2O2处理的HUVECs存活率和迁移率明显降低,凋亡率明显上升。细胞内蛋白分子PI3K、P-AKT的表达量明显降低。且呈浓度和时间依赖效应关系。运用PI3K/Akt信号通路特异性激动剂740Y-P对HUVECs进行干预后,HUVECs存活率和迁移率显著提高,而凋亡率却显著下降。免疫荧光和Western-blot结果显示,740Y-P可明显下调Caspase3和Bax的表达,P-Akt、Bcl-2等蛋白表达显著上调。进一步提示激活PI3K/Akt信号通路可拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤的作用,保护内皮细胞的正常功能。PI3K/Akt信号通路在氧化应激损伤的过程中起着重要的作用。实验二,人脐静脉内皮细胞经过GPS不同浓度与时间干预后,细胞存活率无明显降低。提示GPS对HUVECs无明显毒性作用。H2O2处理的人脐静脉内皮细胞存活率、迁移率及细胞内SOD、GSH-Px含量较control组显著降低,细胞凋亡率及LDH与MDA释放量较control组显著增加。而GPS预处理后,与H2O2组相比,GPS+H2O2组内皮细胞存活率、迁移率及细胞内SOD、GSH-Px含量明显降低,细胞凋亡率及LDH与MDA释放量明显增加。Western-blot结果显示,GPS可以显著下调由H2O2介导细胞内Caspase3、Bax的高表达状态,上调由H2O2介导细胞内PI3K、P-AKT及Bcl-2的低表达状态。提示GPS可有效拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤,其具体的信号转导通路可能与PI3K/Akt相关。实验三,血管内皮细胞经质粒转染PI3K siRNA后,运用Western Blot技术对细胞内PI3K蛋白水平进行检测,发现PI3K蛋白分子的表达明显降低。表明PI3K siRNA成功抑制细胞内PI3K蛋白水平的表达,抑制率达到70%以上。在给予龙胆苦苷及H2O2干预之前给予人脐静脉内皮细胞转染PI3K siRNA。Western blot结果显示,应用PI3K siRNA的HUVEC Caspase3和Bax的表达水平显著升高,而P-Akt、Bcl-2表达显著下降。进一步提示PI3K/Akt信号通路参与龙胆苦苷介导H2O2损伤HUVEC的保护作用。结论:PI3K/Akt信号通路在内皮细胞的氧化应激损伤过程中起着重要的作用,激活PI3K/Akt信号通路可有效的拮抗细胞的氧化应激损伤,保护血管内皮。龙肝苦苷可以有效拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤,且可能通过调控PI3K/Akt信号通路实现。