温度是影响植物生长和分布的重要非生物因子。由于全球变暖,厄尔尼诺现象等因素造成的极端天气频发,低温胁迫越来越成为影响作物生长的重要灾害。因此,研究植物抵抗低温的生理以及分子机制,对帮助改良作物性状具有重要意义。研究人员发现植物置于非致死的低温环境一段时间,其抗冻能力会获得增强,并将这一现象称为冷锻炼。而有关植物冷锻炼过程研究最为透彻的是CBF信号途径。CBF通路以CBF/DREB1转录因子为核心,在拟南芥中由CBF1/2/3三个串联基因组成。CBFs基因会在低温来临时大量表达,进而诱导下游COR基因的表达,这些COR蛋白会通过增加保护性物质,改变细胞膜成分等来帮助植物提高耐受能力。多项研究发现植物激素能够通过影响CBF通路调节植物的冷响应,比如乙烯信号下游的重要转录因子EIN3能够直接结合CBFs基因启动子并负调CBFs基因的表达,从而影响植物耐冻性;茉莉酸甲酯JA信号中的重要负调控蛋白JAZ1能够通过抑制转录因子ICE1的活性负调控CBFs基因表达,施加JA则能够增强植物的耐冻性。油菜素内酯BR作为一类重要的植物激素,影响了植物生长发育的各个方面。研究人员很早就发现施加油菜素内酯可以增强植物的耐寒能力,不过其分子机制并不清楚。为了了解BR信号影响植物冷响应的机制,本项研究利用BR信号相关突变体,从表型筛选开始逐步解决这一问题。首先,本研究对BR信号中重要的负调控因子BIN2相关突变体进行了表型实验,发现BIN2及其同源基因BIL1/2的三突变体bin2-3 bill bil2表现出较野生型更抗冻的表型,而过表达BIN2会削弱拟南芥的抗冻能力,表明BIN2负调控植物的耐冻性。鉴于在BR信号中,BIN2行使其负调控因子功能主要是通过磷酸化并抑制下游重要转录因子BZR1及其同源蛋白BES1的活性。本研究利用定制的BZR1抗体,发现在冷胁迫过程中,BZR1蛋白会快速发生去磷酸化,在4℃处理3 h左右达到一个高峰,表明BZR1会受冷激活;而且冻表型实验发现功能获得性突变体bzr1-1D和bes1-D均表现出抗冻表型,证明BZR1在冷响应过程中起正调控因子的作用。通过分析之前文献发表的ChIP-chip数据发现BZR1和BES1可以结合在CBF1/2的启动子上,本研究利用ChIP和EMSA实验确证了这一结果,并且利用瞬时激活实验证明BZR1可以诱导CBFs基因表达。进一步比较突变体bzr1-1D和野生型植株CBFs及下游基因COR基因的表达情况,充分证明BZR1确实可以诱导CBFs基因表达,并影响下游COR基因的表达。这一部分研究表明BZR1可以受冷激活,进而诱导CBFs基因的表达增强植物的耐冻性,而BIN2则通过抑制BZR1的激活参与植物冷响应过程。通过酵母文库筛选,本研究还发现BIN2蛋白可能与ICE1互作。利用pull-down和Co-IP实验确证了这一互作后,本研究进行了体外磷酸化实验和体内的Phos-tag实验证明BIN2能够磷酸化ICE1。进一步研究发现BIN2磷酸化ICE1会造成后者的降解,并且这种降解会降低ICE1对下游CBFs基因及相应COR基因的表达。最后,本研究利用CRISPR/Cas9成功构建了bin2-3 bill bil2 ice1-3突变体,并进行相关冻表型实验,证明BIN2部分通过ICE1实现对植物冷响应的调控。综合以上结果,本研究一方面发现BIN2可以负调BZR1蛋白在低温下的激活,从而抑制下游CBFs基因的表达,减弱植物的抗冻能力;另一方面,BIN2还能够通过磷酸化ICE1,促进ICE1的降解来降低CBFs基因的表达,削弱植物的抗冻能力。重要的是,本研究还发现BIN2的激酶活性在植物受冷胁迫的早期会急剧降低,而在后期会重新升高。这表明植物在感受到冷胁迫后,会通过某种机制抑制BIN2的作用,增强植物的耐受能力;而在后期,重新释放BIN2的激酶活性,防止过度响应对植物自身造成伤害。这项研究证明BIN2是植物冷响应过程的一个重要开关,对本研究了解植物冷响应过程有重要意义。