论文部分内容阅读
Bmal1作为生物钟环路中的正向因子,可与Clock形成异二聚体,通过绑定per和cry的启动子区域的E-box启动转录。果蝇(Drosophila melanogaster)中cycle基因与bmall基因同源,小鼠(Mus musculus)只有一个Bmall基因,但在斑马鱼(Danio rerio)中有两个bmall基因,分别是bmalla,bmallb。研究发现,在小鼠和果蝇中,敲除Bmall/cycle.其行为节律丧失。本实验室已经对斑马鱼Bmallb的生物钟功能进行了初步分析,结果发现,斑马鱼Bmallb与果蝇CYCLE和小鼠BMAL1存在差异。而斑马鱼Bmal1a的生物钟功能尚不清楚。qRT-PCR实验发现斑马鱼bmal1a的mRNA呈现明显的昼夜节律,通过分析bmal1a基因的启动子,发现两个RORE元件,双荧光素酶报告实验和ChIP实验分别从体外和体内证实生物钟可以通过结合RORE元件直接调节bmal1a基因的表达。为了研究Bmal1a对生物钟的影响,我们利用bmal1a-/-以及bmal1a-/-;bmal1b-/-进行行为实验以及荧光定量实验。行为实验结果显示与WT相比,bmal1a-/-和bmal1a-/-:bmal1b-/-在DD(恒暗)和LL(恒亮)条件下周期延长,相位后移;LD(正常光暗)条件下,bmal1a-/-,.bmal1b-/-活动量明显下降。qRT-PCR结果显示,DD条件下,主要核心钟基因bmal1a在bmal1a-/-中表达上调,而bmal1b,perla,per3和crylbb在bmal1a-/-中表达下调。LD条件下,主要核心钟基因bmal1a,bmalb,bmal2,per1a,per3,cry1bb 在 bmal1a-/-表达明显下调;在bmal1a-/-,.bmal1b-/-中,主要核心钟基因bmal1a,bma12在DD条件下表达明显上调,bmal1b,per1a,per3,cry1bb在DD条件下表达明显下调,在LD条件下,核心钟基因bmal1a,per1a表达上调,bmal1b,bma12,per3,cry1bb表达下调。为了进一步研究Bmal1a对生物钟的影响,我们构建了bmal1a过表达转基因鱼系Tg(hsp70l:bmal1a;CG2)。行为实验结果证明热激过表达bmal1a,斑马鱼的活动量明显增加,行为节律发生改变。qRT-PCR结果显示,主要钟基因bmal1a,bmal2,perla.per3,cry1bb等在bmal1a过表达转基因鱼系中表达发生明显变化。另外,我们还构建了松果体特异性敲除bmal1a的转基因鱼系Tg(U6x:sgRNA(bm alla):LC);Tg(exorh..Cas9:CG2)和松果体特异性过表达bmalla转基因鱼系Tg(exorh:bmal1a;CG2),这将有助于以后更准确地研究Bmal1a在松果体中的功能。综上所述,我们发现bmal1a在斑马鱼生物钟调节中起着重要作用。