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在我国,食管癌(Esophageal Cancer,EC)是消化系统中常见的恶性肿瘤之一,多数为食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC),在食管癌中的比例大于90%。大多数患者出现明显症状后通过内镜活检确诊,很大比例为中晚期,预后较差。早期检测是减轻疾病负担的有效策略。近年来,微小RNA(miRNAs)已被用作血清肿瘤生物标记物。早先研究报道,miR-148a在患有复发性EC的患者中表达不足,是复发性食管癌的肿瘤抑制因子(Tumor Suppressor)。然而,miR-148a在原发性食管鳞癌中是否表达下调及其调控作用仍不清楚。人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen G,HLA-G)是具有免疫调节性质的重要分子,在生理情况下主要分布于胎盘,以往对HLA-G的研究多集中于妊娠合并症、自身免疫性疾病、感染、移植领域。近十余年来,肿瘤领域对HLA-G研究较多,既往研究表明,HLA-G可异位表达于患者的外周血和组织中,HLA-G的异常表达可以使得肿瘤细胞发生免疫耐受、逃逸,并且与不同肿瘤的恶性程度、转移、预后存在密切关系。早先不同的研究分别显示:HLA-G在原发性ESCC组织中具有高表达且与预后相关,HLA-G可由miR-148a调控。本研究的目的在于研究miR-148a、HLA-G在原发性食管鳞癌组织中的表达水平,通过双荧光素酶报告基因实验证实HLA-G是miR-148a调控的一个靶点,免疫荧光(IF)+荧光原位杂交(FISH)检测实验证明miR-148a、HLA-G在食管鳞癌组织中共同表达。同时研究miR-148a在ESCC细胞中对于HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。第一部分miR-148a、HLA-G在食管鳞癌中的表达及意义目的:研究原发食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中miR-148a、HLA-G的表达,探讨Mi R-148、HLA-G在ESCC中的可能作用,对不良预后的可能相关性。方法:对20组不同TNM分期食管鳞癌组织及癌旁组织进行定量实时PCR(Quantitative Real-time PCR)来检测miR-148a、HLA-G的表达水平,miR-148a、HLA-G表达水平的检测以GAPDH为内参照。检验分析miR-148a、HLA-G表达与患者病理TNM分期、预后之间的相关性。结果:q PCR结果显示:食管鳞癌组织与相应癌旁组织中的miR-148a和HLA-G表达有明显差异。食管鳞癌组织中miR-148a的表达明显低于癌旁组织,HLA-G的表达明显高于癌旁组织,差异均具有统计学意义;分析了miR-148a表达水平与病理分期的关系:发现miR-148a低表达的比例在TNM低分期组(Ⅰ期+Ⅱ期)中较低,TNM高分期组(Ⅲ期)中较高,分别是38.5%(5/13)和85.7%(6/7);Kaplan-Meier生存曲线分析同样提示miR-148a显著低表达组的预后明显差于相对高表达组,具有统计学意义。相比较于癌旁组织,HLA-G在食管鳞癌组织样本中显著表达,上调到约4倍(P<0.01),具有统计学意义。HLA-G高表达在TNM低分期组(Ⅰ期+Ⅱ期)中较低,TNM高分期组(Ⅲ期)中较高,分别是15.4%(2/13)和71.4%(5/7)。Kaplan-Meier生存曲线分析提示HLA-G相对高表达组的预后明显差于相对低表达组。差异具有统计学意义。结论:miR-148a、HLA-G可能是食管鳞癌的潜在生物标记物(Biomarker),食管鳞癌组织中miR-148a、HLA-G的表达水平与食管鳞癌的发生、发展相关。第二部分食管鳞癌中miR-148a和HLA-G的调控关系目的:本研究通过生物信息学分析进一步证实miR-148a和HLA-G直接关联,双荧光素酶报告基因分析确认在原发性食管鳞状细胞癌中,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。免疫荧光(IF)+荧光原位杂交(FISH)检测观察食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的表达。方法:根据Targetscan~1数据库,通过计算机辅助得出Mi R148-a具有潜在的HLA-G结合位点。用miR-148a mimics模拟miR-148a表达,将含有HLA-G 3-UTR的双荧光酶报告载体(psi CHECK2)与miR-148a mimic通过lipofectamine 2000共转染于293T细胞。所有瞬时转染和荧光素酶检测样本每个重复3次。免疫荧光(IF)+荧光原位杂交(FISH)检测证实食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的特异性共表达。结果:通过生物信息学分析miR-148a具有HLA-G的结合位点。双荧光素酶报告基因分析确认在HLA-G 3-UTR野生型转染组,miR-148a高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组miR-148a未有这种抑制作用。因此miR-148a与HLA-G的结合是特异性的。miR-148a及HLA-G免疫荧光(IF)+荧光原位杂交(FISH)检测实验可明确观察到Mi R148a、HLA-G在食管鳞癌组织中表达。结论:miR-148a具有HLA-G的结合位点,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。食管鳞状细胞癌中,miR-148a和HLA-G共同表达。第三部分Mi R148a调节HLA-G表达,影响食管鳞癌细胞行为目的:提供上调miR-148a在ESCC细胞中的表达,观察对HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响,探讨miR-148a在ESCC的作用及可能机制。方法:以miR-148a模拟物(Mimic)转染人类ESCC细胞系EC9706,非同源RNA双链体(Non-homologous RNA Duplex)作阴性对照,空载体作空白对照。CCK-8实验检测各组ESCC细胞的活性,侵袭小室实验检测透过侵袭小室的单位面积的ESCC细胞数,分析各组细胞的侵袭能力。用定量实时PCR及免疫印迹试验(Western Blot)来检测HLA-G的表达水平。以膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein Isothiocyanate/Propidium Iodium,Annexin V-FITC/PI)将细胞染色,且通过流式细胞术(Flow Cytometry)来检测细胞凋亡。结果:EC9706细胞中,miR-148a模拟物转染可抑制ESCC细胞活性,降低ESCC细胞侵袭能力,并可诱导细胞凋亡。miR-148a模拟物转染的细胞的凋亡率比空载体转染的细胞或阴性对照的提高了10倍(P<0.01)。同时HLA-G的信使RNA(m RNA)水平及蛋白水平也显著降低(均为P<0.01)。与空白对照组相比,非同源RNA双链体的转染不影响细胞凋亡率或HLA-G的表达。结论:上调miR-148a表达水平可能通过直接调控HLA-G表达,诱导食管鳞癌细胞凋亡,抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭。食管鳞状细胞癌中,miR-148a低表达导致HLA-G异常高表达,从而影响食管鳞癌细胞行为。