乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是一种人嗜肝性、非细胞病变DNA病毒,HBV感染是一个全球性的健康问题,特别是在发展中国家,有约3.5亿人长期慢性感染HBV,每年导致887万人死亡。HBV感染进展的三个主要阶段是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、肝纤维化/肝硬化（liver fibrosis/liver cirrhosis,LF/LC）和肝细胞癌（hepatellular carcinoma,HCC）,被广泛认为是“肝炎三部曲”。慢性乙型肝炎通常以患者异质性和病程长为特征,肝纤维化是伤口愈合反应;两者都是从慢性肝病到肝硬化乃至HCC的必经阶段。尽管目前诊断和治疗取得了很大的进步,但大多数HCC患者预后不佳,5年总生存率＜50%;多项研究表明LF和LC是可逆的。因此,早期识别和诊断在HBV相关肝脏疾病的管理中至关重要。目前,针对HBV相关肝脏疾病的特异性临床无创诊断方法较少。诊断肝纤维化或肝癌的金标准仍然是基于组织病理学的方法,然而这种方法是具有潜在风险或并发症的侵入性手术。甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）是用于HCC诊断和疗效检测的常用的生物标志物,但准确性和可靠性较低。因此,迫切需要一种新的无创方法来诊断和区分HCC、LF/LC和CHB,以进一步提高这些患者的生存结局。生物标志物通常是指疾病相关的蛋白质或生化指标,研究表明HBV相关肝脏疾病不同阶段基因和mRNA表达谱不同,mRNA可被翻译成蛋白质,且血液样本易于获得,方便用于临床实践。综上,本研究旨在识别并验证HBV系列肝脏疾病关键mRNA分子,以早期诊断并预测疾病进展。第一部分基于转录组高通量测序筛选HBV相关系列肝病发生发展主导mRNA目的:发现和筛选HBV相关肝病进展过程中的关键mRNA。方法:基于肝组织病理学诊断,选择健康对照（CON,4例）、慢性乙型肝炎（CHB,5例）乙肝肝纤维化/肝硬化（LF/LC,5例）及相关肝细胞癌（HCC,5例）4组人群肝组织样本,进行高通量测序检测mRNA表达谱;进行生物信息学分析,通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和趋势分析（short time-series expression miner,STEM）,筛选出HBV相关系列肝脏疾病发生发展过程中关键分子,并通过GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能分析预测主导基因的生物功能。结果:1.mRNA的差异表达及初步分析:应用柱状图、韦恩图和火山图来描述mRNA的表达情况。与对照组相比,慢性乙型肝炎组共检测到1581个明显差异表达mRNA,其中上调的有901个,下调的有2680个;乙肝肝纤维化/肝硬化组有2141个明显差异表达的mRNA,其中1493个上调,648个下调;在肝细胞癌组,共有1588个明显差异表达mRNA,包括1130个上调的mRNA和458个下调的mRNA。2.筛选健康对照、慢性乙型肝炎及乙肝肝纤维化/肝硬化病程进展中关键分子:对CON、CHB、LF/LC三组样本共同表达的所有的mRNA进行趋势分析,主流表达趋势为呈递增趋势的趋势集7,其中12个mRNA的每组样本平均FPKM值大于1.5,结合功能分析并查阅文献,选择水通道蛋白1（aquaporin 1,AQP1）、肌营养不良蛋白聚糖1（dystroglycan 1）和人血红蛋白β（hemoglobin subunit beta,HBB）进行后续分析。3.筛选慢性乙型肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝细胞癌疾病进展关键分子:对CON、CHB、LF/LC、HCC四组样本测序所得的mRNA对应基因进行WGCNA分析,选择与肝纤维化及肝癌相关的黄绿色、绿色、绿松石色和白色模块;同时对所有mRNA进行趋势分析,选择在4组中呈递增趋势的趋势集。综合WGCNA和STEM分析,选择Shc衔接蛋白1（SHC adaptor protein 1,SHC1）、SLAM家族成员8（SLAM family member 8,SLAMF8）、白介素32（interleukin-32,IL-32）、整合素β2（integrin subunit beta 2,ITGB2）、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF）、串联C2结构域核（tandem C2 domains nuclear,TC2N）、突触足蛋白（synaptopodin,SYNPO）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP-glucose pyrophosphorylase 2,UGP2）、含有纤维蛋白样细胞外基质蛋白1（EGF-containing fibulin extracellular matrix protein 1,EFEMP1）这9个指标进行后续诊断标志物分析。结论:1.结合高通量测序、STEM和功能分析并查阅文献,选择AQP1、DAG1和HBB,进行后续健康对照、慢性乙型肝炎及乙肝肝纤维化/肝硬化疾病进展关键生物标志物鉴定分析。2.综合转录组测序、WGCNA和STEM分析,选择SHC1、SLAMF8、IL-32、ITGB2、MANF、TC2N、SYNPO、UGP2和EFEMP1这9个指标,进行后续健康对照-慢性乙型肝炎-乙肝肝纤维化/肝硬化-肝细胞癌疾病进展关键生物标志物进一步筛选及验证分析。第二部分HBV相关慢性肝炎、肝纤维化/肝硬化病程进展诊断标记物及模型的建立与验证目的:验证筛选出的分子的表达趋势,并据此建立诊断模型,以早期识别HBV相关肝病的发生并评估其进展。方法:应用免疫组化染色检测靶mRNA编码的蛋白在三组人群的表达趋势。临床数据分为训练集（n=150）和验证集（n=230）中进行验证,采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中上述指标的浓度。采用受试者操作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析评价各指标的诊断效能。结果:1.正常及病变肝组织中AQP1、DAG1和HBB免疫组化染色:积分光密度（Integral optical density,IOD）分析显示,AQP1、DAG1和HBB在LF/LC患者的肝脏表达最高,其次是CHB患者,健康对照组表达量最低,组间两两比较均有显著差异（P＜0.05）。2.通过ELISA初步验证候选生物标志物:随着HBV相关肝脏疾病病情逐渐严重,男性受试者比例、年龄、AST、TBIL、铁蛋白、APRI、FIB-4、AQP1、DAG1和HBB水平呈递进上升趋势,ALB、WBC、PLT水平在疾病进程中逐渐下降。3.训练集中HBV系列肝脏疾病病程进展相关因素分析:多元有序逻辑回归分析提示,age、PLT、AQP1和DAG1是HBV相关肝脏疾病病程进展的独立影响因素。4.训练集中建立基于mRNA标志物的诊断模型:基于2种mRNA,结合age、PLT建立APAD模型。在区分CHB患者与健康人群时,界值为2.021,APAD模型的灵敏度、特异度最高,曲线下面积（area under the curve,AUC）值最高为0.963。以2.873作为判定阈值,可将LF/LC与CHB患者进行区分,其敏感性为96.0%,特异性为90.0%。与其它指标比较,APAD模型的诊断性能最高,明显优于FIB-4、APRI和肝脏硬度测量（Liver stiffness measurement,LSM）,且3D模型表明APAD模型可明确区分健康对照、慢性乙型肝炎及乙肝肝纤维化/肝硬化三组人群。5.验证集中验证mRNA标志物和APAD模型:验证集中呈递进增加或减少趋势的变量与训练集中的变量一致。APAD模型在鉴别LF/LC患者和CHB患者、CHB患者和健康志愿者时的诊断效能最大,明显优于其他变量（年龄、PLT、AQP1、DAG1、FIB-4和APRI）。结论:1.新型诊断标志物AQP1、DAG1可用于区分“LF/LC患者与CHB患者”、“CHB患者与健康对照组”。2.基于年龄、PLT、AQP1和DAG1建立的APAD模型诊断效能最大,明显优于FIB-4、APRI和LSM等临床常用无创指标,且3D模型表明APAD模型可明确区分健康对照、慢性乙型肝炎及乙肝肝纤维化/肝硬化三组人群。第三部分慢性乙型肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝细胞癌疾病进展关键分子的确立及验证目的:识别并验证HBV相关慢性肝炎、肝纤维化/肝硬化和肝细胞癌患者发生发展的新型生物标志物。方法:应用定量逆转录酶聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）及免疫组化（immunohistochemical,IHC）试验验证所选指标表达趋势与高通量测序结果的一致性。然后,利用验证组200个血浆样本和测试组400个血浆样本,用ELISA检测筛选靶蛋白的表达水平。采用ROC分析衡量每个指标的诊断效能。结果:1.qRT-PCR初步验证mRNA表达情况:肝组织PCR试验检测第一部分所选9个指标表达水平,发现SHC1、SLAMF8、IL-32、ITGB2、MANF、TC2N、SYNPO和EFEMP1在正常、慢性乙型肝炎、乙肝肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌四组中呈逐渐增加表达趋势。应用qRT-PCR进一步验证外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）9个mRNA的表达水平,发现SHC1,SLAMF8和IL-32在四组样本呈递进增高表达趋势。2.正常及病变肝组织中SHC1、SLAMF8、IL-32、ITGB2、MANF免疫组化染色:积分光密度（IOD）分析显示,SHC1、SLAMF8和IL-32在HCC患者的肝脏表达最高,其次是LF/LC患者、CHB患者,健康对照组表达量最低。ITGB2和MANF在LF/LC表达量最高,明显高于CHB和对照组,但HCC患者肝组织中ITGB2和MANF表达水平下降。3.验证集中健康对照、慢性乙型肝炎、乙肝肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌人群基本特征:随着HBV相关肝脏疾病病情逐渐严重,男性受试者比例、年龄、AST、铁蛋白、FIB-4、APRI、SHC1、SLAMF8和IL-32水平逐渐升高,而WBC、PLT和ALB水平逐渐下降。4.验证集中HBV系列肝脏疾病病程进展相关因素分析:单因素和多因素有序逻辑回归分析结果表明,age、PLT、铁蛋白、SHC1、SLAMF8和IL-32是HBV相关系列肝脏疾病发生发展的独立影响因素。5.筛选并建立新型生物诊断标志物及诊断模型:基于3种mRNA,结合age、PLT、铁蛋白建立APFSSI模型,其在区分CHB患者与健康人、LF/LC与CHB患者、鉴别HCC与LF/LC患者时,诊断效能最大。6.在测试集中验证新型生物诊断标志物及诊断模型:测试集中呈递进增加或减少趋势的变量与验证集中的变量一致,APFSSI模型在鉴别诊断CHB、LF/LC或HCC患者的诊断性能最高,均优于其他参数。结论:1.SHC1、SLAMF8、IL-32可区分“HCC患者与LF/LC患者”、“LF/LC患者与CHB患者”、“CHB患者与健康对照组”。2.基于年龄、PLT、铁蛋白、SHC1、SLAMF8和IL-32建立的APFSSI模型诊断效能最大,根据相应界值有助于区分HBV不同疾病阶段,为HBV相关慢性肝炎、肝纤维化/肝硬化及肝细胞癌患者早期诊断提供依据。