论文部分内容阅读
【目的】建立用实时荧光定量RT—PCR法在mRNA水平上检测肿瘤细胞中多药耐药基因(mdr-1基因)表达的方法，实现对肿瘤细胞中mdr-1 mRNA快速，准确的检测，对临床治疗和肿瘤预后判断提供辅助手段。 【材料与方法】 1．细胞培养：用含10％小牛血清的RPML1640培养基对乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR于孵箱内单层连续传代培养，用0.25％的胰酶及0.25％的EDTA用直接吹打法传代。 2．细胞和组织总RNA提取：用Biozol试剂分别提取乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR细胞和人乳腺癌肿瘤组织中的总RNA。 3．cDNA的合成：以所提取的乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR及人乳腺癌肿瘤组织所提取的RNA为原料分别进行逆转录反应，获得cDNA。 4．PCR反应及重组质粒的构建：以乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADR逆转录的cDNA为模板，进行普通PCR扩增。扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶回收法进行纯化。用PGEM—T Easy质粒载体连接PCR纯化产物，构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选重组质粒。 5．荧光定量PCR标准曲线的建立：优化荧光定量PCR体系和条件，并以重组质粒为标准品建立检测mdr-1 mRNA的标准曲线。 6．用所建立的荧光定量PCR方法对58例乳腺癌标本中mdr-1 mRNA的含量进行测定，同时用免疫组化的方法检测标本中P-gP的表达，两种方法进行比较，采用X~2检验对数据进行统计学分析。 【结果】构建了mdr-1基因的重组质粒，并且成功转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选提取重组质粒，对质粒进行梯度稀释，以稀释的质粒为模板优化荧光定量PCR体系和条件，建立最佳荧光定量PCR体系，