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禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV属于冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的γ型冠状病毒,病毒颗粒外包囊膜,内含不分节段的单股正链RNA基因组。泛素蛋白酶体系统简称为UPS(Ubiquitin–Proteasome System),能够降解错误折叠或受损的蛋白质,从而维持细胞内的蛋白质稳态,同时在细胞周期调控、信号转导、转录调控、细胞凋亡、抗原递呈等许多细胞生理活动中起着关键的作用。目前有不少报道表明病毒的感染依赖于UPS,包括MHV等冠状病毒。然而,UPS对IBV增殖的影响,尚不清楚。本研究以Vero细胞、H1299细胞、和鸡胚胎成纤维细胞DF-1为细胞模型,采用多种方法研究UPS对IBV感染和增殖的作用。一、抑制UPS系统,不利于IBV的感染和增殖IBV感染Vero、H1299、或DF-1细胞,在不同的感染时间点,分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin或Bortezomib,感染后12小时收样,通过Western blot检测病毒蛋白N的表达,并通过荧光定量RT-PCR检测病毒基因组,探讨UPS对病毒增殖的影响。结果表明,在感染后0到6小时加入UPS抑制剂,明显降低病毒蛋白的表达和病毒基因组RNA的水平。之后,将UPS抑制剂处理细胞的时间点精细化,发现抑制剂主要在感染后0到2小时抑制IBV入侵。以猪传染性腹泻病毒PEDV感染Vero细胞,同样发现,在感染后0到2小时加入UPS抑制剂,显著降低病毒的入侵和增殖。以上结果表明,UPS可能在病毒的入侵阶段发挥作用。二、UPS在IBV内吞后和基因组起始翻译之前发挥作用接下来,我们探讨UPS在病毒入侵的哪个阶段发挥作用。IBV的入侵包括吸附、内吞、胞内运输、膜融合、和脱壳。完成脱壳后,以病毒基因组RNA为模板,翻译病毒的开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)1a和1ab,合成病毒复制所需要的酶,再对病毒基因组进行复制。在感染后2小时检测内吞的病毒基因组,发现UPS抑制剂并不干扰细胞对病毒的内吞。在感染后5小时检测病毒ORF1a和ORF1ab的翻译,发现UPS抑制剂处理显著降低ORF1a和ORF1ab的翻译。通过嘌呤霉素标记实验,检测细胞内蛋白的合成效率,结果表明UPS抑制剂处理2个小时,并没有显著影响细胞的蛋白翻译效率。因此,ORF1a和ORF1ab的翻译减少,并非由于蛋白翻译效率下降导致。内吞的病毒没有减少,而起始翻译出来的蛋白显著降低,说明UPS抑制剂在病毒内吞之后和基因组复制之前发挥作用,极有可能作用于病毒的胞内运输、膜融合、或脱壳等步骤。三、IBV入胞需要相关蛋白泛素化修饰进一步研究发现,UPS抑制剂处理细胞后,细胞内游离的泛素蛋白单体明显减少,泛素化修饰的蛋白明显增多,说明UPS抑制剂可能通过阻止蛋白降解和泛素蛋白单体的循环利用,耗尽泛素蛋白单体,进而影响相关蛋白的泛素化修饰及其功能,从而影响病毒的感染效率。采用泛素蛋白激活酶E1抑制剂PYR-41处理细胞,抑制相关蛋白的泛素化,发现在IBV感染后0-2小时加入PYR-41,明显降低病毒的增殖,证实了相关蛋白泛素化修饰对病毒入胞的必要性。