第一部分多发性骨髓瘤干细胞样细胞分选及生物学特性的初步分析目的：探讨分选多发性骨髓瘤干细胞(MM-TSCs)样细胞的不同方法,并对不同方法分选出的细胞进行干细胞生物学特性的初步分析。方法：采用免疫磁珠分选6例初诊MM患者新鲜标本的CD138-细胞；常规培养4种骨髓瘤细胞株(RPMI8226、U266、XG-4、XG-7);采用添加了表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养法富集干细胞。采用流式细胞术检测不同方法得到细胞中SP细胞比例,并分选骨髓瘤细胞株PRIM8226中的SP细胞。对不同方法分离出的细胞进行干细胞生物学特性的鉴定：通过生长曲线、MTT检测其增值情况；流式细胞术分析细胞周期；激光共聚焦显微镜观察细胞表面CD38表达；集落形成实验检测其克隆形成能力；PCR检测经典干细胞基因的表达；裸鼠体内成瘤试验检测细胞体内成瘤能力。结果：本研究成功分选6例初诊MM患者新鲜标本中CD138-细胞,检测其SP细胞比例分别为：1.42%、1.64%、1.37%、1.54%、1.71%、0.84%。检测4种MM细胞株(RPMI8226、U266、XG-4、XG-7)中SP细胞比例分别为1.78±0.89%、0.825±0.53%、0.082±0.022%、0.177±0.05%；并成功分选PRIM8226中的SP细胞。经添加细胞生长因子的无血清培养富集后SP细胞占3.65±0.51%。磁珠分选CD138-细胞、流式分选SP细胞及无血清富集后细胞生长特点有所不同,但增殖能力无明显差异。CD138-细胞、SP细胞及无血清富集细胞处于GO／G1期的细胞比例分别为30.41±1.3%、44.34±1.7%、36.15±1.1%；均高于NSP细胞(28.49±1.1%),NSP组和CD138-组间差异无统计学意义(p>0.05)、NSP组和SP组、无血清富集组间差异均有统计学意义(p<0.05)。激光共聚焦显微镜下可见三种细胞均有CD38表达。集落形成实验显示：CD138-细胞、SP细胞及无血清富集细胞都具有较强的集落形成能力。单细胞克隆直径、克隆形成数、克隆形成率分别为：(0.198±0.022、0.280±0.016、0.215±0.010)、(708±81、1722±127、1124±105)、(35.4%、86.1%56.2%),三者间差异无统计学意义(p>0.05)。三种细胞的集落形成能力均明显高于NSP细胞(0.118±0.019、358±14、17.9%),差异有统计学意义(p<0.05)。RT-PCR结果显示三种细胞都有干细胞经典标记c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因的表达,三种细胞同一基因表达率无显著性差异(p>0.05)。三种细胞干细胞相关基因表达均高于NSP细胞,表达率差异有统计学意义(p<0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示三种细胞均可在裸鼠体内成瘤,成瘤所需最小细胞数数量级相同(成瘤所需最小细胞数分别为2*103、5*103、5*103),瘤体大小相似,成瘤能力无显著性差异,各组间差异无统计学意义(p>0.05)。对剥离的瘤体进行了H&E染色病理镜检和抗人的CD138、CD34抗体标记的免疫组织化学染色及镜检。证明接种细胞形成肿瘤,瘤体来源于人的细胞,表达MM免疫标志CD138,瘤体内新生血管起源于人的CD34+细胞。结论： MM细胞株及MM患者新鲜标本中均存在一定比例SP细胞,免疫磁珠分选、流式细胞术分选及无血清富集方法均可分选出具有一定干细胞特性的细胞,从而成为分选MM肿瘤干细胞的方法。三种方法各有利弊,可结合使用。第二部分Cx43及其组成的GJIC在骨髓微环境支持MM干/祖细胞生存中的作用及机制目的：研究不同来源的骨髓间充质干细胞对骨髓瘤干/祖细胞的生存及耐药产生的作用,并探讨连接蛋白CX43及其组成的GJIC在其中作用。方法：1.分离培养患者来源(MM-MSCs)和正常对照的间充质干细胞(ND-MSCs),与RPMI8226细胞或流式细胞术分离的SP细胞建立直接共培养体系.2.在共培养体系中加入通道阻断剂18α甘草次酸(α-GA)前后分别通过生长曲线和MTT检测其增值情况；流式细胞术分析SP细胞比例及细胞周期,检测硼替佐米诱导的细胞凋亡；集落形成实验检测其克隆形成能力；RT-PCR检测干细胞经典标记c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因表达；裸鼠体内成瘤实验检测体内成瘤能力。3. WesternBlot检测Cx43蛋白表达水平及核蛋白P65的变化,分析GJIC与下游IKKB/NFkB信号通路变化的相关性,加入信号通路抑制剂后检测信号通路的变化。结果：1.成功分离、培养获得患者来源及正常对照的BMMSCs,二者在平均传代时间、生长曲线、增殖能力无明显差异；流式术检测其细胞表型,均高表达CD73(98.0%)、CD44(100%)、CD90(99.8%)、CD105(100%),不表达CD34(0.3%), HLA-DR (0.2%)等造血细胞表面标志；进行成骨及成脂诱导鉴定其具有多向分化能力。与流式术分选的SP细胞建立直接共培养体系。2.与正常对照ND-MSCs共培养相比,与患者来源的BMMSCs与RPMI8226SP细胞直接共培养后SP细胞比例增加,促进其增殖；提高细胞周期中G0/G1期细胞比例；增加其体外克隆形成能力；并介导其对硼替佐米(BTZ)耐药；部分上调干细胞相关基因表达水平；增加对裸鼠的体内成瘤能力。而在共培养体系中加入通道阻滞剂,功能性阻断细胞间通道连接后可使SP细胞比例下降,增殖活性减弱；处于G0/G1期细胞比例降低；降低体外克隆形成能力；部分恢复MM细胞对BTZ的敏感性；部分下调干细胞相关基因表达水平；略降低对裸鼠的体内成瘤能力。与对照组ND-MSCs共培养结果差异有统计学意义(p<0.05)。3-MM-MSCs在蛋白水平上Cx43表达高于ND-MSCs, SP细胞在蛋白水平上Cx43表达低于NSP细胞。与MM-MSC共培养的SP细胞短时间内CX43表达上调,但是与对照组差异无统计学意义(p>0.05)。阻断下游IKkB/NFkB信号通路后,通道阻断剂作用减弱。结论：患者来源的BMMSCs具有更强的促进骨髓瘤干细胞增殖,并通过提高处于GO期细胞比例介导其对BTZ耐药、增加集落形成率及裸鼠致瘤性的能力,其作用与GJIC功能密切相关,Cx43/NFkB信号通路可能是其作用机制之一。第三部分Cx43组成的GJIC在骨髓瘤干细胞诱导的微环境重塑中作用目的观察MM干细胞诱导微环境重塑过程中发生EMT/MET转化与Cx4343与其组成的GJIC的相关性及可能机制。方法采用流式细胞仪分选多发性骨髓瘤细胞株PRIM8226SP细胞,与骨髓瘤患者来源(MM-MSCs)、正常对照来源的间充质干细胞(ND-MSCs)及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养后,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,细胞免疫荧光染色观察上皮细胞标志蛋白和间质细胞标志蛋白的表达MTT法检测对SP细胞增殖的影响,WesternBlot方法检测E-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达变化,。检测共培养后ERK1/2表达水平结果分选出的PRIM8226SP细胞与ND-MSCs、MM-MSCs、HUVEC长期直接共培养后,MM-MSCs细胞及HUVEC细胞形态发生明显变化,增殖速度增快。细胞免疫荧光染色及WesternBlot方法观察了E-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达变化,发现MM-MSCsE-钙黏蛋白表达上调而α-SMA蛋白表达下调；HUVEC细胞E-钙黏蛋白表达下调而α-SMA蛋白表达上调。共培养后MM-MSCs的ERK1/2蛋白表达上调,而HUVEC的ERK1/2表达下调,加入通道阻滞剂后趋势更加明显。结论MM干细胞可诱导微环境重塑,GJIC在促进EMT/MET相互转化过程中具重要作用,MAPK/ERK信号通路可能是作用机制之一。