E-cadherin是一种介导同质细胞间相互粘附的Ca2+依赖性跨膜糖蛋白,主要分布于上皮组织中,其基因CDH1定位于染色体16q22.1,cDNA全长48 kb,在胞质内先合成135 kDa的蛋白前体,经剪切修饰成熟后转移至细胞膜发挥其生物学功能。E-cadherin的胞外区是由5个串联重复的结构单元构成,每个结构单元大约含有110个氨基酸残基,相邻的重复结构单元之间是Ca2+的结合位点,其中第一个重复序列(最外侧)包含一个“组氨酸-丙氨酸-缬氨酸”(HAV)三肽的模体,它决定着E-cadherin与同质细胞间的特异性识别和相互作用。跨膜区由32个氨基酸组成的疏水结构域。E-cadherin的胞内域含有SH1和SH2区:SH1区可以和β-catenin(γ-catenin)直接结合;SH2区和p120ctn结合,发挥调节粘附分子二聚体聚集和解离的作用。目前的研究结果表明,β-catenin和p120-catenin均为E-cadherin复合体的重要调节蛋白,可以通过调节E-cadherin复合体的稳定性,进而调节细胞-细胞间的粘附。　　 根据剪切部位的不同,p120ctn可以分为四种亚型,并且在哺乳动物的不同部位的正常组织及肿瘤组织内,p120ctn所表达的亚型不同,具有组织特异性。目前的研究结果表明,p120ctn在E-cadherin不同表达的情况下,会表现出截然不同的两种生物学作用,目前,对于p120ctn各亚型在肺癌组织中的原位表达情况及p120ctn各亚型在E-cadherin存在或不完全缺失的状态下的作用的研究还未见到直接的报道。　　 β-catenin既参加E-cadherin复合体,又是Wnt信号通路中重要的信号传递子。E-cadherin复合体与Wnt信号传导通路之间的相互作用,共同影响着肿瘤的发生发展。在肿瘤的发生发展过程中常伴有Wnt信号通路的异常激活;并且E-Cadherin异常表达常与肿瘤细胞的低分化、高侵袭性、转移性相关。而在这一过程中β-catenin起到桥梁作用。但是在肺癌中,究竟是E-cadherin复合体还是Wnt信号通路发挥更重要的作用,目前尚无定论。　　 本研究旨在讨论p120亚型1在83例肺鳞癌、腺癌中的表达及其与预后等各临床病理因素之问的关系,分析p120亚型1的表达与总p120ctn及E-cadherin表达之间的联系和区别。　　 方法：　　 1、肺癌组织　　 83例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌标本来自1998年2月至2000年九月在中国医科大学第一附属医院行外科手术切除的标本。其中男49例,女34例。42例新鲜肺癌组织来自中国医科大学附属第一临床学院2008-2009年原发性肺癌患者外科手术切除标本。患者的生存期的计算是从手术日期到随访日期,或由于复发、转移而死亡的日期为止。所有患者术前均未接受放化疗,术后常规化疗。83例具有随访资料的标本均经4％中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。42例新鲜肺癌组织一部分标本在切下后5分钟内取材并迅速置液氮中速冻,然后置于-80℃深冻冰箱保存备用,另一部分标本离体后用中性福尔马林固定。所有标本的使用均征得了患者本人同意,签订知情同意书。　　 2、免疫组织化学染色及结果判定SP染色试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物技术公司。单克隆抗体p120亚型1(1:100稀释,Abcam Cambridge MA,美国),pan-p120ctn(1:400稀释,BD Transduction Laboratories,美国),β-catenin(1:400稀释,BD TransductionLaboratories,美国),E-cadherin(1:150稀释,Santa Cruz Biotechnology,美国)4℃孵育过夜。以正常支气管粘膜上皮细胞着色强度和定位为阳性对照,PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。每张切片随机选取5个高倍视野,每高倍视野计数100个瘤细胞,无着色为(-),总p120ctn、β-catenin和E-cadherin:膜着色清楚、连续且阳性细胞数≥90％定义为正常表达;膜表达减弱、消失和/或细胞浆/核中出现≥10％的阳性表达均视为异常表达;p120亚型1:细胞浆中表达＜10％定义为正常表达,≥10％则为异常表达。　　 3、细胞培养和5-aza-dC处理人肺巨细胞癌PG亚系BE1细胞由北京医科大学惠赠,其余肺癌细胞系购自中科院上海细胞所。细胞系培养于含10％胎牛血清,2.3g/L NaHCO3、100U/ml青链霉素的RPMI1640培养液中,每2天用0.25％胰酶消化传代。5-aza-dC直接加入培养基,终浓度7μmol/L,每天换液加药,继续培养48小时。　　 4、细胞免疫荧光染色细胞爬片后,4％多聚甲醛室温固定,0.2％Triton X-100处理15分钟,1％BSA封闭30分钟,滴加鼠抗人单克隆anti-β-catenin抗体和anti-E-cadherin抗体,4℃孵育过夜,滴加TRITC标记羊抗鼠荧光标记二抗,稀释比例为1:100,37℃孵育1小时,DAPI核复染。荧光显微镜观察荧光信号,CoolPIX5400照相机拍摄荧光图片。　　 5、RT-PCR采用Trizol试剂提取肺癌组织或培养细胞的总RNA,利用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒进行反转录。以β-actin为内参,β-catenin的PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后,成像分析。　　 6、Western Blot将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体β-catenin4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2小时后DAB或ECL显色。　　 7、甲基化特异性PCR提取组织和细胞基因组DNA,采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(北京天漠),按照试剂盒说明书操作对基因组DNA进行甲基化转变。取甲基化产物利用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增,PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖,120V电泳30min,EB染色,凝胶成像系统下观察。　　 8、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖能力取对数生长期的肺癌细胞悬液(细胞密度3×105个/ml)分别接种于4个96孔板培养板,每板分6组:空白组(A)(B),干扰对照组(C)、干扰组(D)、抗体抑制对照组(E)和抗体移植组(F)。培养第24、48、72小时分别加入MTT(5mg/ml)20μl,继续孵育4小时后,每孔加入150μlDMSO溶解结晶,选择波长490nm,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。实验重复5次。绘制细胞生长曲线。　　 9、体外基质胶侵袭实验(Transwell)检测细胞侵袭能力按照BD公司说明操作,取100μl细胞悬液(5×106个/ml)滴入上室内,下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液,上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开,将小室置37℃,5％CO2条件下放置后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel胶,100％甲醇固定30分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。　　 10、统计分析应用X2和Fisher检验对蛋白表达与组织学特征以及临床指标间的关系进行统计学处理。所有统计学处理均采用SPSS软件系统SPSS for Windows13.0进行统计学分析。　　 结果：　　 1、p120亚型1与总p120ctn和E-cadlaerin的表达模式不同,p120亚型1的过表达总是与总p120ctn的异常表达一致,并与E-cadherin的表达相关免疫组化染色表明:在正常支气管上皮细胞中总p120ctn和E-cadherin呈连续的膜表达,同时也可以在近膜的胞浆内呈现弱阳性表达。而p120亚型1在正常支气管上皮细胞中不表达或仅呈胞浆内的弱表达,其胞浆弱表达的阳性细胞数＜10％。但是在非小细胞肺癌组织中,p120亚型1在肺癌细胞浆中表达强度增加,阳性细胞数常常＞10％,我们将这种异常表达定义为过表达,其过表达率为48.2％。　　 在83例非小细胞肺癌组织中,总p120ctn的异常表达率为69.9％(58/83),p120亚型1的过表达率为48.2％(40/83),E-cadherin的异常表达率为72.3％(60//83)。当总p120ctn的细胞膜表达明显减弱或缺失时,p120亚型1在细胞浆中则表达增强,p120亚型1过表达的40例全部包含在总p120ctn异常表达的58例中,换句话说,p120亚型1过表达的40例同时也具有总p120ctn的异常表达。并且我们发现,在总p120ctn在细胞膜上正常表达的25例中,p120亚型1也均为正常表达。在E-cadherin异常表达的60例中,有40例的p120亚型1为过表达,而在E-cadherin正常表达的23例中,p120亚型1也均为正常表达,在所有40例p120亚型1异常表达的病例中,E-cadherin均为异常表达。因此,我们认为p120亚型1在细胞浆中的过表达总是与总p120ctn和E-cadherin的异常表达相关。　　 2、p120亚型1在肺鳞癌、腺癌组织中的过表达与肺癌患者临床病理因素相关,是影响预后的独立因素我们对p120亚型1在肺鳞癌、腺癌组织中的过表达与肺癌患者临床病理因素之间的关系进行了统计学分析。结果显示,p120亚型1过表达与淋巴结转移、低分化、组织学类型和高级别TNM分期正相关(P＜0.05)。绘制生存曲线,并将各临床病理因素输入Cox模型,分别采用Enter法和Forward Stepwise LR法分析(表3),结果表明:淋巴结转移情况、TNM分期总p120ctn的异常表达和p120亚型1的过表达分别为影响肺癌患者预后的独立因素(P＜0.05)。　　 3、非小细胞肺癌组织中β-catenin启动子区CpG岛存在高甲基化现象,高甲基化可以抑制β-catenin的表达,并与其在细胞膜上表达的减弱或缺失及肺癌患者的临床病理因素相关MSP检测42例新鲜的非小细胞肺癌组织中β-catenin启动子区域CpG岛的甲基化情况。结果发现,在42例癌组织中,有69.0％(29/42)的病例中β-catenin启动子区域CpG岛存在甲基化,明显高于癌旁正常肺组织内28.6％(12/42)的甲基化率。RT-PCR检测mRNA水平的变化,与癌旁正常肺组织相比,β-catenin mRNA表达水平不变或升高的有22例,其中β-catenin启动子区发生甲基化的占54.5％(12/22),而β-catenin mRNA表达水平下降的有20例,其中β-catenin启动子区发生甲基化却占到了85.0％(17/22),二者具有明显的相关性(P＜0.05)。统计学分析结果显示,β-catenin启动子高甲基化与其在细胞膜上的表达减弱或缺失正相关(P＜0.05),并与肺癌患者的淋巴结转移、低分化和高级别TNM分期正相关(P＜0.05)。　　 4、非小细胞肺癌细胞系中去甲基化处理可以恢复β-catenin的表达,E-cadherin膜表达不同的细胞系去甲基化后β-catenin的亚细胞定位及侵袭能力的变化趋势不同MSP筛选人正常支气管上皮细胞系及5种非小细胞肺癌细胞系中β-catenin启动子区CpG岛的甲基化情况。选择了β-catenin启动子区CpG岛存在高甲基化现象的SPC和LTE细胞系加入5-aza-dC进行去甲基化处理。应用RT-PCR和Western Blot检测β-catenin mRNA水平及蛋白表达,发现去甲基化后,β-catenin无论在转录水平还是在蛋白表达水平都有不同程度的恢复。免疫荧光及Transwell检测发现,在E-cadherin无细胞膜表达的SPC细胞系中,5-aza-dC处理后,β-catenin增多但位于胞浆内,细胞的侵袭能力增强;而在E-cadherin存在膜表达的LTE细胞系中,-catenin增多并表达在细胞膜上,细胞的侵袭能力下降。　　 结论：　　 1、p120亚型1在非小细胞肺癌的细胞浆内过表达,而且p120亚型1在细胞浆内的过表达与非小细胞肺癌患者的临床病理因素相关,并且p120亚型1的过表达常常与总p120ctn和E-cadherin的异常表达相关。同时,p120亚型1在细胞浆中的过表达还是非小细胞肺癌患者不良预后的标志,有可能作为非小细胞肺癌患者预后判定的重要指标。　　 2、在非小细胞肺癌中,β-catenin的细胞膜表达与E-cadherin的细胞膜表达具有很好的一致性。在β-catenin启动子区CpG岛中,肺癌细胞存在高甲基化现象,并且高甲基化抑制了β-catenin的表达,造成β-catenin表达下降,同时通过与钙粘蛋白复合体间的相互作用,促进了非小细胞肺癌的侵袭转移能力。