背景：　　 冠状病毒是一类单股正链RNA病毒[1]，属于冠状病毒科的冠状病毒属，基因组长度约为27-33kb，是RNA病毒中基因组最长的一类呼吸道病毒[2]。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，分为三组[3]：第一第二组主要感染哺乳动物，第三组仅感染禽类。人类冠状病毒229E、OC43是普通感冒的主要病原体之一。2003年，一种以引起严重急性呼吸综合症(severeacuterespiratorysyndrom，SARS)[4]为临床表现的新型冠状病毒的爆发流行及其高致病性和高致死率引起了全世界的重新关注，随后对于冠状病毒的不断深入研究，相继又发现两种新的人类冠状病毒HCoV-NL63[5，6]和HCoV-HKU1[7]，而现有研究怀疑冠状病毒可能存在未发现的毒株或新变异毒株，因此针对冠状病毒的深入研究依然具有重大的公共卫生意义。SARS的危害性，引起无数研究者的深入关注，而对目前已知的除SARS-CoV之外的其他四种冠状病毒免疫学特征的研究，对防治SARS-CoV的再次蔓延及新型毒株的诊断、防控及治疗有重大意义。　　 研究目的:　　 应用原核表达载体，对HCoV-NL63核衣壳蛋白N端(1-163aa)、C端(141-306aa)基因片段进行原核表达，制备相应的非融合蛋白Np、Cp及融合纯化蛋白Np-SA、Cp-SA，建立WBLA方法比较HCoV-NL63全长核衣壳蛋白Nf、核衣壳蛋白N端(Np)、C端(Cp)在血清学检测中的差别，从而建立特异、灵敏、简易并可推广应用的HCoV-NL63血清学检测方法与试剂。　　 方法与结果:　　 本研究采用pET30-a(+)原核表达系统，在不改变读码框情况下，我们利用合适的酶切位点将六个HIS加入目的基因羧基端，分别构建了携带有HCoV-NL63N蛋白N端(1-163aa)，C端(141-306aa)基因片段的表达质粒pET30a-Np、pET30a-Cp、pET30a-Np-SA、pET30a-Cp-SA，将其转化于BL21(DE3)感受态细胞，通过优化IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件使得Np、Cp两种HIS标签蛋白均得到了可溶性表达，两种融合蛋白均以包涵体的形式存在。Westernblot验证目的蛋白与抗HIS抗体结合情况，结果表明四种蛋白均得到了正确表达。　　 原核表达系统大量表达目的蛋白后我们通过镍离子金属螫合层析纯化的方法得到了纯度达95％以上的HIS标签蛋白，应用Westernblot验证纯化蛋白与HCoV-NL63感染者阳性血清特异性结合情况，结果显示人类冠状病毒NL63N蛋白N端、C端均与HCoV-NL63阳性血清有特异性结合，证明表达的蛋白具有生物活性。　　 我们采用WBLA(Westernblotlineassay)方法利用纯化的两种非融合蛋白Np、Cp及全长N蛋白平行筛查了50份体检血清中抗体存在情况及三种蛋白在血清学检测中的差异，Westernblot结果显示：HCoV-NL63人群普遍感染，50份体检血清中，N全长蛋白(Nf)、N端(Np)、C端(Cp)分别检出25、27、36份抗体阳性血清，检出率分别为50％、54％、72％。N全长蛋白、N端一致率64％，N全长蛋白、C端一致率54％，N端、C端一致率54％。　　 总结：　　 本研究成功构建了HCoV-NL63N蛋白N端和C端及其与链亲和素融合基因的原核表达质粒并得到了相应的纯化蛋白，Westernblot结果显示四种蛋白均得到了正确表达。应用非融合纯化蛋白Np、Cp检出阳性血清，WBLA结果显示HCoV-NL63N蛋白N端、C端均能检测出冠状病毒HCoV-NL63感染的阳性血清，且C端较N端及全长N蛋白检出率都高，从结果可以看出对HCoV-NL-63核衣壳蛋白的研究，能够为HCoV-NL63特异性免疫学诊断试剂的研究提供了理论依据和实验材料。