研究背景近年来,冠心病、动脉粥样硬化、高血压、高血脂等心脑血管疾病发病率在全球范围内逐年上升,且发病年龄明显提前,严重危害人类的健康。心血管疾病的发生是由遗传因素和环境因素长期共同作用的结果。而对于心血管疾病发生的分子机制,许多研究仍未完全阐明。众多研究表明,内皮的损伤、炎症反应的发生以及凝血系统的异常激活等因素是导致动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展的重要病理因素,三者之间相互交联,相互促进。生理情况下,内皮细胞可维持血管内平衡、维持血管紧张度及防止血栓形成等。但是,高血糖、胰岛素抵抗及氧化应激、炎性反应等因素可引起内皮损伤。而内皮的损伤又可加重炎症的发生,并可激活凝血系统导致血栓形成,而凝血系统的激活又进一步加重炎症的进程,严重者导致内皮功能障碍,从而促进动脉粥样硬化的发生。TF是激活外源性凝血途径级联反应的始动因子和促炎症介质,是凝血-炎症网络的关键枢纽分子。TF的异常表达可导致凝血系统的异常激活进而导致血栓的形成,同时又加重炎症反应的进程,对心血管疾病的发生起重要的作用。研究表明,脂多糖LPS、肿瘤坏死因子TNF-α等炎性因子可通过激活MAPK信号通路以及NF-kB、AP-1、Egr-1等转录因子而诱导内皮细胞或单核细胞TF的表达。除TF外,其他炎症分子如ICAM-1, IL-6等也在心血管疾病的发生中起重要的作用。众多研究提示,促进内皮损伤的修复以及有效抑制TF等炎症因子的作用是心血管疾病防治策略制定的重要靶点。TIPE2属于肿瘤坏死因子Q诱导蛋白8家族,主要表达在淋巴组织和炎症组织中,是一种新发现的炎症负性调节因子,在保持免疫平衡中发挥着至关重要的作用。研究表明,TIPE2可调节巨噬细胞对oxLDL介导的炎症反应,且TIPE2缺陷的小鼠可导致动脉斑块形成增加。此外,TIPE2是MAPK和NF-kB信号途径的抑制因子。在LPS刺激的巨噬细胞中,TIPE2可抑制JNK和p38MAPK的活化,从而下调AP-1等转录因子的活化。因此,TIPE2作为免疫炎性负调控分子可通过调节MAPK信号通路抑制炎症反应的发生,而TF的表达又受MAPK信号通路的调控。那么,TIPE2是否在内皮细胞中表达,TIPE2与TF的关系如何?目前尚不清楚。慢病毒重组载体近年来已是常用的基因转移工具,它可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,并在体内长时间表达,具有转导效率高且安全性较高等优点,是当前基因转移载体研究的热点。本课题预实验结果提示,HUVEC可表达少量TIPE2蛋白,因此可利用过表达技术对TIPE2基因功能进行研究。基于以上背景,本研究的主要目的是通过构建TIPE2基因过表达慢病毒载体,并探讨内皮细胞中过表达TIPE2对TF表达的影响及相关机制,从而为进一步了解心血管疾病发病机制及防治策略的制定提供理论依据。第一部分TIPE2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定研究目的通过构建TIPE2基因过表达慢病毒载体,为后续对TIPE2基因功能研究提供实验基础。研究方法1.构建TIPE2过表达慢病毒载体：设计扩增TIPE2基因的特殊引物,采用PCR扩增技术获得人源TIPE2目的基因片段并将其进行纯化。将纯化后的PCR产物与经AgeI/AgeI酶切后回收的线性化载体GV287进行同源重组；将连接产物进行转化涂板、挑取克隆、扩增培养、提取质粒后酶切并进行PCR扩增,然后经琼脂糖凝胶电泳鉴定连接产物,最后进行测序鉴定。2. GV287-TIPE2’慢病毒载体的包装及滴度测定：将已携带目的基因TIPE2的慢病毒载体与工具载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞包装制备慢病毒颗粒。3.病毒颗粒滴度测定：收获及浓缩病毒颗粒,采用RT-qPCR方法检测慢病毒滴度。实验结果1.TIPE2目的基因片段与GV287载体成功连接,测序鉴定结果与目标序列完全一致。2.成功包装TIPE2-GV287慢病毒载体颗粒,RT-qPCR方法检测病毒滴度为2.00E+8TU/ml.结论1.成功构建TIPE2基因过表达慢病毒载体GV287-TIPE2。2. TIPE2过表达慢病毒载体可用于下一部分实验研究。第二部分慢病毒介导的TIPE2过表达载体对脐静脉内皮细胞TF表达的影响及其机制研究研究目的：探究TIPE2基因与TF的关系,为进一步了解动脉粥样硬化等心血管疾病发病机制及防治策略的制定提供理论依据。研究方法1. HUVEC脐静脉内皮细胞株的培养：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,并在37-C,5%CO2及一定湿度的细胞培养箱内培养。2.将THP-1细胞设为对照细胞,提取HUVEC细胞及THP-1细胞总蛋白,western blot方法检测HUVEC细胞中TIPE2蛋白水平的基础表达量。3.不同浓度的LPS刺激HUVEC细胞并检测TIPE2及相关炎性因子的表达。不同终浓度LPS刺激分组如下：①CON②0.1μg/ml③0.25μg/ml④0.5μg/ml⑤1μg/ml；采用RT-qPCR法检测各组TIPE2、TF、ICAM-1、IL-6等mRNA的表达情况；采用western blot的方法检测各组TIPE2、TF的蛋白表达情况。4.LPS在不同时间点刺激HUVEC细胞并检测TIPE2及相关炎性因子的表达。时间梯度分组如下：①CON②30min③1h④4h⑤8h⑥12h;采用RT-qPCR方法检测各组TIPE2、TF、ICAM-1、IL-6等mRNA的表达情况；采用western blot的方法检测各组TIPE2、TF的蛋白表达情况。5.慢病毒载体感染HUVEC细胞：将构建好的TIPE2基因过表达慢病毒载体颗粒及阴性对照,依据最佳感染指数(MOI值)对HUVEC细胞进行感染,并采用western blot检测感染后TIPE2蛋白表达情况。6.采用CCK8法检测TIPE2过表达后HUVEC细胞增殖情况。7.检测TIPE2过表达后对TF、ICAM-1、IL-6等基因基础表达的影响,以及LPS刺激条件下,TIPE2对其的影响,实验分组如下：①NC②TIPE2③NC+LPS④TIPE2+LPS; RT-qPCR法检测各组TF、ICAM-1、IL-6等基因mRNA的表达情况；采用western blot的方法检测各组TIPE2、TF的蛋白表达情况。8.检测TIPE2过表达后,p38、ERK1/2等MAPK信号通路的变化。实验结果1.与THP-1细胞相对比,HUVEC细胞表达少量TIPE2蛋白。2.不同终浓度的LPS刺激HUVEC细胞后,RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比,LPS刺激的各实验组的TIPE2基因mRNA表达水平均显著降低(p<0.05),其蛋白表达水平也明显下降。3.在不同时间点用LPS刺激HUVEC细胞后,RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比,LPS刺激的各实验组的TIPE2基因mRNA表达水平均显著降低(p<0.05),其蛋白表达水平也明显下降。4.不同终浓度的LPS刺激HUVEC细胞后,与对照组相比,TF和IL-6的mRNA在LPS刺激的各实验组中均表达升高(p<0.05), ICAM-1mRNA在0.5μg/ml组、1μg/ml LPS组中表达升高(p<0.05); Western blot检测结果表明,与对照组相比,TF在0.25μg/ml、0.5μg/ml LPS组中蛋白水平表达明显升高。5.在不同时间点用LPS刺激HUVEC细胞后,与对照组相比,TF在4h组、8h组中表达升高(p<0.05), ICAM-1mRNA在4h组、8h组、12h组中表达升高(p<0.05), IL-6mRNA在30min组、1h组、4h组、8h组中表达均升高(p<0.05)；Western blot检测结果表明,与对照组相比,TF在1h组、4h组、8h组、12h组中蛋白表达水平明显升高。6. TIPE2-GV287’慢病毒载体成功感染HUVEC细胞,NC组与过表达组均可见大量绿色荧光,western blot检测结果表明过表达组TIPE2蛋白水平显著升高。7.细胞增殖实验CCK8实验结果显示,与阴性对照组相比,在48h和72h时,过表达TIPE2的细胞增殖率显著较高(p<0.05), HUVEC细胞在48h和72h处增殖较快。8. TIPPE2对TF、ICAM-1、IL-6mRNA表达的影响。与阴性对照组相比,过表达TIPE2组TF、ICAM-1、IL-6mRNA水平明显下降(p<0.05)；同时在LPS刺激下,过表达TIPE2组的TF mRNA水平明显下降(p<0.05),但对ICAM-1、 IL-6mRNA的影响无统计学意义。9. Western blot结果表明,与阴性对照组相比,过表达TIPE2组TF蛋白表达水平明显降低；同时在LPS刺激下,过表达TIPE2组的TF蛋白水平升高的幅度比未过表达组明显要低。10. Western blot检测p38和ERK1/2信号通路结果表明,与阴性对照组相比,过表达TIPE2组在LPS刺激15min、30min、60min后,磷酸化的p38水平明显降低；而过表达TIPE2的各组细胞磷酸化ERK1/2的水平却比阴性对照组显著增高。结论1.HUVEC细胞表达少量TIPE2蛋白,且LPS刺激可显著降低TIPE2的表达。2.LPS可诱导HUVEC细胞TF、ICAM-1、IL-6等炎性因子表达水平增高。2.慢病毒载体GV287-TIPE2成功转染HUVEC脐静脉内皮细胞,过表达组的TIPE2蛋白水平明显增高。3.过表达TIPE2后可增强HUVEC细胞的增殖能力。4. TIPE2可抑制HUVEC细胞TF、ICAM-1、IL-6等炎性因子的基础表达；且TIPE2可抑制LPS诱导的TF的表达,但对LPS诱导的ICAM-1、IL-6水平增高无明显影响,这表明TIPE2可调节HUVEC细胞TF、ICAM-1、IL-6等因子的表达水平。5. TIPE2可下调MAPK信号通路中p38的磷酸化水平,但可上调ERK1/2磷酸化水平,这可初步表明TIPE2可通过调节MAPK信号通路来调节内皮细胞TF等炎症因子的表达及细胞增殖状况。