目的：　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎症性自身免疫性疾病，其主要的病理特征是滑膜炎症，滑膜组织的增生，炎性细胞的浸润，血管翳的形成，进而侵蚀软骨和骨组织，最终导致关节畸形和功能丧失。RA在世界范围内的患病率约为0.5％-1％，我国的患病率约为0.3％-0.6％，是一种致残率较高的疾病，严重影响患者的生活质量，因此该疾病给患者和社会都造成了沉重的经济负担。　　RA的病因及发病机制尚未完全明确，成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)作为RA的主要效应细胞，一直是RA研究的热点。近年来研究表明，RA FLS增生活跃，具有肿瘤细胞的生物学性，主要表现为异常过度的增殖，非锚定依赖性生长，抵制凋亡刺激，导致凋亡不足，侵袭性增高，产生促炎因子以及促进软骨破坏的蛋白激酶和趋化因子等，从而形成错综复杂的细胞因子网络，使滑膜炎症持续存在，并促进滑膜新生血管的形成。新近的研究结果显示:活化的RA FLS可以迁移很长一段距离，并能在一定程度上将RA关节炎症播散至未受累及的其他关节。因此，调节RAFLS迁移和侵袭等生物学活性，识别新的生物学信号分子作为RA治疗的新靶点显得尤其重要。　　鞘脂代谢产物是细胞内重要的信号转导分子，在调节细胞增殖、分化和凋亡的动态平衡中，具有举足轻重的地位。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SPHK1)是细胞内鞘脂代谢的关健酶，主要表达在细胞质及细胞核周围，在特定的激动剂作用下转位到细胞膜上并磷酸化生成1磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-1phosphate，S1P)。S1P作为SPHK1的下游代谢产物，能调节细胞增殖、分化、迁移、接触和黏附、存活以及血管的形成，调控多种肿瘤细胞的生物学活性。最近越来越多的研究证实，SPHK1/S1P参与RA的发生与发展，并有望成为RA治疗的新靶标。　　RA发病过程中涉及多种信号通路，3-磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路作为细胞内主要的信号转导通路之一，广泛存在于滑膜组织，调控RA FLS的生长、增殖、生存和凋亡。有研究证实，SPHK1的下游代谢产物S1P能够通过PI3K/AKT信号途径调节肌纤维细胞的增殖和迁移。对于体外培养的人胶质瘤细胞，SPHK1能激活AKT抵制细胞凋亡，而且SPHK1能提高AKT活化和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)诱导的细胞周期蛋白D的表达，从而促进细胞的存活和增殖。而且，越来越多的证据表明PI3K/AKT信号通路调控多种细胞的迁移和侵袭，由此，我们推测SPHK1可能通过PI3K/AKT信号通路进而调控RA FLS迁移和侵袭的能力。　　金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶家族，能有效地降解细胞外基质，在肿瘤的生长、转移过程中均起着重要作用。MMPs在多种肿瘤细胞的侵袭过程中发挥作用，而且涉及细胞的迁移以及血管的新生。RA FLS分泌MMPs，降解细胞外基质，破坏骨质，参与血管翳的形成，加速关节血管的形成。既往研究证实，PI3K/AKT信号通路及下游分子MMP-2和MMP-9能参与多种肿瘤细胞的迁移和侵袭，而且，过度表达的MMP-2和MMP-9能促进RA FLS的侵袭，但其具体信号机制尚不明确。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表达可能减少RA FLS的迁移和侵袭能力，识别调控MMP-2和MMP-9表达的因子可能是RA治疗的新靶点。　　小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。此技术是一种抑制特定基因产物的有效方法，具有特异性高、沉默效率高、稳定性好等优点。siRNA技术已广泛应用到生命科学的各个领域，如基因功能测定、恶性肿瘤、病毒性肝炎和艾滋病治疗等。　　本研究拟通过检测及分析RA患者滑膜组织中SPHK1的表达，并通过siRNA技术靶向沉默SPHK1基因，观察SPHK1对RA FLS增殖、迁移和侵袭能力的影响;以特异性信号阻断剂LY294002作为干扰手段，探讨SPHK1调节RA FLS迁移和侵袭的信号转导途径，探讨SPHK1在RA发病中的可能作用机制。　　实验方法：　　1.通过手术获取的RA和OA患者滑膜组织，一部分用4％多聚甲醛固定后行免疫组化染色检测SPHK1的表达;一部分置于-80℃冰箱中冻存行Western blot检测SPHK1的蛋白水平。体外培养成纤维样滑膜细胞(RAFLS)，免疫组化染色进行鉴定并检测SPHK1在RA FLS中的表达及定位。　　2.Lipofectamine2000转染SPHK1 siRNA至RA FLS，实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)筛选出有效的SPHK1 siRNA片段。使RA FLS SPHK1基因表达沉默后，WST-1法检测SPHK1对RAFLS增殖能力的影响。采用Transwell小室系统检测SPHK1对RA FLS迁移和侵袭能力的影响。Western blot法检测SPHK1蛋白水平，探讨SPHK1是否调控RAFLS的生物学活性。　　3.对体外培养的RAFLS加入特异性信号阻断剂LY294002，Transwell小室系统检测SPHK1对RAFLS迁移和侵袭能力的影响。Western blot法检测3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)和磷酸化蛋白激酶B(phospho-Akt，p-AKT)蛋白水平，ELISA检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的分泌水平，探讨SPHK1调节RAFLS迁移和侵袭的可能信号转导途径。　　结果：　　1.RA患者滑膜组织SPHK1蛋白水平高于OA患者，但差异无统计学意义(P＞0.05)。体外培养的RAFLS经光镜和免疫组化法鉴定符合RAFLS特征。RAFLS中可见SPHK1表达，主要位于细胞质及细胞核周围。　　2.筛选出1679序列是针对人SPHK1的特异性siRNA，抑制率约为72.2％。沉默RAFLS中的SPHK1基因表达，SPHK1蛋白水平下降，RAFLS的增殖、迁移和侵袭能力明显受抑制，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　3.在RAFLS中SPHK1基因表达沉默后，我们发现PI3K、p-AKT蛋白水平减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，AKT蛋白水平无明显改变，差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞上清液中MMP-2和MMP-9分泌降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。特异性信号阻断剂LY294002能进一步减少SPHK1 siRNA所致的PI3K、p-AKT蛋白表达及MMP-2和MMP-9的分泌，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　结论：　　1.RA患者滑膜组织SPHK1表达和蛋白水平增高，RA FLS中SPHK1表达增多，提示SPHK1可能参与了RA的发生发展。　　2.RA FLS中SPHK1基因表达沉默后，抑制了RA FLS的增殖、迁移和侵袭能力。这种抑制作用可能与SPHK1蛋白水平减少有关。说明SPHK1可能是参与RA FLS增殖、迁移和侵袭的重要因素之一。　　3.特异性信号阻断剂LY294002能减少SPHK1基因表达沉默所致的RA FLS的迁移和侵袭能力。RA FLS中SPHK1基因表达沉默后，PI3K、p-AKT蛋白水平减少，MMP-2和MMP-9分泌降低。SPHK1siRNA抑制RA FLS迁移和侵袭可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路的活化及MMP-2和MMP-9的分泌实现的。