DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit)，与另外两个亚单位Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物，其中Ku70和Ku80组成的异二聚体是调节亚基。DNA-PKcs也称为PRKDC基因，目前已知人类该基因组全长250kb，有86个外显子。比较小鼠、鸡、非洲蟾蜍和人DNA-PKcs氨基酸序列发现，他们都拥有相同的保守结构域：PI-3K结构域、亮氨酸拉链、CPP32切割位点、Ku和c-Ab1结合结构域以及KIP结合位点。人DNA-PKcs的cDNA全长13509bp，编码区12387bp，其编码的蛋白分子量为465kDa，由4127个氨基酸残基组成。其激酶活性区域位于羧基端(3719～4127氨基酸残基之间)，与磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K，phosphatidylinositol-3-kinase)催化区高度同源，具有Wortmannin敏感的Ser／Thr蛋白激酶活性，与ATM、ATR、RAP等同属于磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)超家族成员。体外实验表明DNA-PKcs可磷酸化多种底物，包括Ku、XRCC4、RPA、c-Ab1、p53、C1D、c-myc、c-fos、TopⅠ、TopⅡ以及RNA聚合酶Ⅱ、TFⅡD、oct-1等。目前已知DNA-PKcs的生物学功能有：参与DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)、V(D)J重组和维护端粒结构等。由于其具有激酶活性，推测其具有更广泛的生理功能，因此，其生物学功能和作用机制仍然受到关注。 本论文在本课题组所建立的α-粒子诱发的人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化细胞模型的基础上对DNA-PKcs的表达及其功能进行了研究，以探讨DNA-PKcs功能变化与细胞癌变的关系，取得了如下进展： (1)研究发现BEP2D恶性转化细胞克隆中存在DNA双链断裂修复缺陷，为了进一步探讨其中的分子机制，我们利用半定量RT-PCR或Northern blot杂交检测了7个DNA链断裂修复相关基因的mRNA表达水平。结果表明其中某些DNA修复相关基因(XRCC-2、XRCC-3、XRCC-5)mRNA表达下调了2.5-6.5倍。但更令我们意外的是DNA-PKcs的表达在细胞恶性转化早期阶段受到抑制，但发生恶性转化后，部分癌变细胞DNA-PKcs的mRNA水平得到了恢复，有的甚至上升了2.4倍。Western Blotting检测其蛋白水平也是增高的。在此结果的提示下，我们通过免疫组化检测了14例肺癌组织和对应癌旁组织DNA-PKcs蛋白表达水平，结果也表明癌组织细胞的表达明显高于癌旁组织。 (2)通过体外磷酸化酶活性检测，发现癌变细胞中DNA一PKcs酶活性要明显高于亲本细胞和转化前细胞。这显示该基因的表达变化及激酶活性的升高，可能与细胞的癌变相关，由此提示该基因不仅仅是参与DNA双链断裂修复，还可能具有更广泛的生物学功能。 (3)在HeLa细胞中通过免疫共沉淀获得一与DNA一PKcs相互作用的蛋白，对其进行质谱分析和蛋白数据库检索，初步鉴定该蛋白是CydinTZ。其后，通过westem Bloting检测，结果首次证实DNA一PKes与CychnTZ确实存在相互结合作用，而对照中未能检测到二者的相互作用。目前所知的CyclinTZ的生理功能是与CDKg构成转录延伸因子P一TEFb，后者磷酸化RNA聚合酶最大亚基的梭基末端结构域(cTD)。本论文将对DNA一PKes与CycllnTZ相互作用的生物学意义进行讨论，如DNA一PKcs还可能具有新的生理功能—如参与转录偶联修复(TCR)反应或基因转录调节作用，尤其是后者可能与细胞的恶性转化相关。 (4)利用Rr-PcR从DNA一PKcss‘端克隆到犯obp大小的cDNA片段并构建了由四环素诱导控制表达的反义核酸载体pCIneo一tet一sPlice，用LIPofectamine介导转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞，挑选10个转化克隆扩增培养，利用Weste邝blotting从中鉴定出DNA一PKcs蛋白表达被反义核酸抑制的3个细胞克隆，同时利用细胞克隆形成法分析了各个克隆对UV的敏感性。结果表明DNA一PKcs表达抑制后细胞对UV辐射的敏感性明显增加，表现为细胞存活率降低。由此建立了可用于DNA-PKcs更深入生物学功能机制研究的细胞模型。 本课题研究认为，DNA一PKcs在不同细胞系中的表达变化及其激酶活性水平的不同，可能在Q一粒子导致细胞恶性转化中发挥了一定作用。研究还发现人肺癌组织细胞的DNA一PKcs表达也明显提高。与此同时，本科题组另一项工作中还发现人肝癌组织细胞中DNA一PKcs表达增加，并与细胞的恶性程度和浸润特性相关。本研究的创新之处在于首次发现DNA一PKcs的表达增加可能与细胞恶性转化相关，并首次发现DNA一PKes与cychnTZ的相互作用，但二者具体作用机制及下游分子学事件和生物学意义尚待进一步探讨。所建立的表达DNA一PKes反义核酸的细胞模型，为进一步探讨DNA一PKcs的作用机制奠定了基础。