高分辨率熔解曲线分析技术自从2003年被开发以来,因其具有明显优点而被迅速的应用到各个领域的研究中。HRM通过饱和染料对PCR产物的熔解曲线变化进行实时监测,不需要使用针对目标位点的特异性等位引物或探针,只需一对引物就可以对等位基因的变化进行识别。其灵敏度高、特异性强、简单快速、高效、经济,同时HRM检测不受碱基位点的局限,还具有高通量、闭管操作等优点,非常经济有效。本文首先通过检测ALDH2多态性建立快速高效的HRM检测系统,然后利用HRM对新生儿缺陷相关基因MTHFR和MTRR基因多态性位点进行检测,证明HRM可很好的应用于临床单基因遗传病的检测,快速准确。同时,我们还试着利用HRM对激活因子样效应核酸酶(TALEN)切割基因产生突变的效率进行检测,结果也表明HRM可用于对大样本的未知突变位点的突变效率进行检测。HRM是快速、有效、经济、方便的检测单基因疾病以及突变的方法。第一部分通过检测乙醛脱氢酶(ALDH2)基因多态性建立HRM的检测系统目的探索DNA浓度以及纯度对HRM灵敏性与准确度的影响,建立多态性位点的HRM检测体系。方法收集正常血样.抽取血液DNA并定量。设计ALDH2基因的rs671特异性HRM引物,采用直接测序法以及HRM对其进行检测,并比较检测结果。结果经HRM法,96例未知基因型的样本中,检测出67例野生型ADLH2*1/1(G/G),26例杂合型ADLH2*1/2(G/A),3例突变型ADLH2*2/2(A/A),与测序结果一致。结论HRM分析法是一种具有简单、快速,经济、高效以及高通量等优点的遗传学分析方法,可以用于对ALDH2基因突变进行快速检测,同时,可以应用到其他基因多态性的检测。第二部分应用HRM检测新生儿出生缺陷相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因多态性目的利用HRM对MTHFR的两个SNP位点和MTRR的一个SNP位点分别进行检测,探讨HRM对SNP检测的准确性,为临床上新生儿出生缺陷相关基因多态性的快速检测与治疗提供参考。方法收集正常血样,抽取血液DNA并定量。设计MTHFR两个SNP位点c.677C>T和c.1298A>C和MTRR的一个SNP位点c.66A>G的特异性HRM引物,利用HRM法对其进行检测,然后取部分样本测序,比较检测结果。结果经HRM法,96例未知基因型的样本中,MTHFRc.677C>T位点检测61例为C/C型,31例为C/T型,4例为T/T型；MTHFR c.1298A>C位点检测出50例为A/A型,30例为A/C型,16例为C/C型；对MTRR c.66A>G位点检测出51例为A/A型,40例为A/G型,均与测序结果一致。结论HRM可快速准确地检测新生儿出生缺陷相关基因多态性,是一种高效的可应用于临床的检测方法。第三部分应用HRM检测TALEN切割基因产生变异的效率目的探讨通过HRM对未知基因突变位点进行检测的可行性,为基因突变模型构建的检测建立快速、准确、高效的检测平台。方法构建特异性敲除MSTN基因的TALEN质粒,进行细胞转染实验、小鼠尾静脉快冲实验以及小鼠受精卵微注射实验得到相应的基因敲除DNA,然后设计特异性引物进行HRM检测,同时对相应样本进行测序,将HRM与直接测序结果相比较。结果HRM法检测DNA突变分型结果为：7个孔的293T细胞DNA样本分型为三组,实验组与对照组明显分开,实验组中也有不同变异显示的不同分型；10例小鼠肝脏DNA样本HRM分型为三组,1号为一组,2、3号为一组,剩余对照分为一组;受精卵显微注射后存活的45只小鼠中有6只发生变异,以其中的4和6号作为亲本,与正常小鼠交配产生F1代,检测后选出亲本交配产生F2代。整个过程均用HRM作快速筛选,与测序结果相比,正确率100%。结论HRM可以作为突变快速检测的一种优选方式,准确率高,可适用于多样本的筛选,节省大量时间与成本。