论文部分内容阅读
花生是重要的油料和经济作物,花生种皮色泽存在较大差异,具有白色、红色、紫色、粉色及花斑类型,花斑种皮花生是其中的独特成员。本研究采用花斑种皮花生VG-01为材料,研究花生花斑种皮色素代谢途径中的差异基因,为揭示花斑花生花青素合成分子调控机制奠定基础,对促进花斑花生功能基因组学研究有重要意义。有关花斑花生种皮花青素合成的分子调控机制的结果如下:1.选取花斑花生VG-01种皮开花下针和45d的非着色区B1,B2和着色区F1,F2的RNA为实验材料,采用RNA-Seq技术进行分析,使用Illumina测序平台测序,4组样品差异表达基因个数及上下调情况利用DEGseq软件进行分析。结果表明1050个差异表达基因被筛选出来,其中27个差异表达基因与花生种皮颜色形成高度相关的,包括3个PAL,1个C4H,2个CHS,1个F3H,1个F3’H,2个DFR,2个LAR,2个IAA,4个bHLH,9个MYB调节基因。其中F1-B1总差异基因214个,上调基因53个,下调基因161;F2-B2总差异基因348,上调基因97个,下调基因251;F1-F2总差异基因213个,上调基因169个,下调基因44;B1-B2总差异基因4152,上调基因82个,下调基因70。2.对测序结果与二倍体野生种和四倍体栽培种花生参考基因组进行比对分析,进行功能注释。差异表达基因GO功能了解行使的主要生物学功能,差异表达基因利用Pathway分析参与的生物代谢和信号转导途径,依据KEGG数据库筛选出差异表达基因富集的代谢通路。GO（Gene Ontology）功能分析表明,差异基因被显著富集在代谢过程与分子功能组分,富集的GO条目有:催化活性（GO:0003824）、有机代谢过程（GO:0071704）、分子功能（GO:0003674）、绑定（GO:0005488）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析筛选出6条与花青素生物合成相关的代谢途径,包括苯丙氨酸代谢（Phenylalanine metabolism）,苯丙醇生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）,黄酮和黄酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）,类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）,植物激素信号转导（Plant hormone signal transduction）以及昼夜节律植物（Circadian rhythm-plant）。3.对着色区与非着色区的代谢产物测定后进行分析,结果表明,着色区与非着色区共检测出12种差异产物。包括原花青素A1,A2,B2,B3、牵牛花色素3-O葡萄糖、花翠素、花翠素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-半乳糖苷、矢车菊素O-丁香酸和松香花青素O-己糖苷。在花生种皮着色区（F）与非着色区（B）开花下针（DAF）的F1-B1比较组中,牵牛花色素3-O葡萄糖苷,矢车菊素O-丁香酸含量着色区低于非着色区,差异倍数分别为2.12和1.42;原花青素A1、A2、B2、B3,花翠素,矢车菊素,松香花青素O-己糖苷,矢车菊素3-O-半乳糖苷8种代谢产物含量着色区高于非着色区,差异倍数1.51～3.51;在花生种皮着色区（F）与非着色区（B）开花下针（DAF）45d的F2-B2比较组中,着色区的矢车菊素3-O-半乳糖苷和矢车菊素O-丁香酸含量低于非着色区,差异倍数分别为0.63和2.35;着色区的松香花青素O-己糖苷,原花青素A1、A2、B2、B3、矢车菊素,花翠素,花翠素3-O葡萄糖苷和矢车菊素3-O-半乳糖苷含量高于非着色区,差异倍数1.05～11.55。测定结果比较分析表明矢车菊素和华翠素是造成花生种皮形成花斑的决定性色素。4.转录组与代谢组联合分析表明,黄酮生物合成代谢途径相关联差异基因最多,且该途径直接影响花翠素和矢车菊素的合成。参与花生种皮颜色形成的基因包括3个PAL,1个C4H,2 个 CHS,1个 F3H,1个 F3’H,2 个 DFR,2 个 LAR,2 个 IAA。发育过程中3个PAL、1个C4H,2个CHS非着色区较着色区均下调表达,2个DFR,2个LAR,2个IAA非着色区较着色区均上调表达。5.依据测序所需序列库合成相应的cDNA序列,设计荧光实时定量PCR（Quantitative Real-time,qRT-PCR）引物对转录组测序结果中与种皮颜色形成的差异基因进行验证。采用荧光定量PCR的方法,将筛选出来的20个差异表达基因进行验证,F1-B1和F2-B2均有11个基因得到验证,F2-B2有9个基因得到验证,B1-B2有12个基因得到验证,F1-F2有11个基因得到验证。被验证的差异表达基因荧光定量PCR变化趋势与转录组测序结果差异倍数相近。6.研究表明与花斑种皮颜色合成相关差异miRNA富集的代谢途径有苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、异黄酮的生物合成,昼夜节律-植物。miRNA测序结果中筛选出86个差异表达miRNA,20个差异表达的miRNA与花生种皮颜色花青素的合成相关,包括4个同时靶向花青素、类花青素和IFS靶基因的miR8、miR50、miR51和miR239-x;5个调控花青素生物合成中结构基因:调控CHS靶基因的miR398-x,调控4CL靶基因的miR482,调控F3’H靶基因的miR266和miR182以及调控花青素3-O-葡萄糖苷靶基因的miR5;miR858-y靶向花青素生物合成中的调节基因,调控 MYB2 和 MYB3;10 个靶向 CYP450 靶基因的 miR10、miR15、miR61、miR72、miR102、miR116、miR123、miR193、miR256 和 miR862-z。miRNA 测序与转录组联合分析KEGG富集表明类黄酮生物合成是花生种皮花斑形成最直接的代谢途径。总之,黄酮生物合成代谢途径是花生种皮花斑形成最直接的代谢途径,花翠素、矢车菊素含量不同是花生种皮形成色斑的主要代谢物质。花生花斑种皮发育过程中着色区与非着色区的14个主要结构酶基因和13个调节基因影响花生种皮花斑的形成,包括苯丙氨酸酶、肉桂酸-4-羟化酶、查尔酮合成酶、二氢黄酮醇3-羟化酶、二氢黄酮醇-3’-氢化酶、二氧黄酮醇-4-还原酶以及无色还原酶和4个bHLH,9个MYB调节基因。为揭示花斑花生花青素合成分子调控机制奠定基础,为花生遗传改良提供候选基因,同时对于促进花斑花生功能基因组学研究有重要意义。