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L-天冬酰胺酶(L-ASN,EC 3.5.1.1),是一种酰胺基水解酶,能催化天冬酰胺生成天冬氨酸和氨。近来,因其能有效降低淀粉食品中致癌物质丙烯酰胺,在食品安全领域受到国内外的高度关注,其市场需求量逐年提升。然而现在天然菌株产L-ASN产量较低,且重组菌表达多集中在大肠杆菌(Escherichia coli)或欧文氏菌(Erwinia)等非食品级宿主,因此通过基因工程、分子改造及发酵优化手段实现L-ASN在食品级宿主中的高效表达具有重要的意义。本研究选择来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的L-ASN,将其表达于食品级宿主B.subtilis WB600,并进一步通过分泌信号肽筛选、等离子诱变及发酵优化等策略大大提高了L-ASN发酵产量。本研究的主要研究结果如下:(1)L-ASN在B.subtilis WB600中的表达以 B.subtilis 168基因组为模板,通过同源序列比对设计PCR引物,成功得到了L-ASN的编码基因ans Z。经序列分析,ans Z基因5’端编码19个氨基酸的分泌信号肽。将完整序列和缺失N-端信号肽序列的ans Z分别连接至空质粒p MA5上得到表达质粒p MA5-ans Z和p MA5-ans Z△(SP),化学转化法将质粒转化至B.subtilis WB600得到重组菌。摇瓶发酵结果显示,表达p MA5-ans Z质粒的重组菌胞外L-ASN酶活达15.8 U?m L-1,SDS-PAGE分析亦能检测到L-ASN条带;表达p MA5-ans Z△(SP),胞外未检测到酶活,仅在胞内有少量L-ASN积累。上述结果表明,B.subtilis 168来源的L-ASN的天然信号肽能有效介导其分泌表达。(2)信号肽筛选强化L-ASN在B.subtilis WB600中的分泌将 ans Z△(SP)基因分别连接到信号肽ywb N、wap A、npr E、vpr、ync M、yvg O和opp A基因3’端,构建得到重组质粒p MA5M、p MA5H、p MA5E、p MA5G、p MA5J、p MA5L和p MA5F。将重组质粒转化B.subtilis WB600,获得了重组菌WB-M、WB-H、WB-E、WB-G、WB-J、WB-L和WB-F。经酶活分析,重组菌胞外酶活水平在0~32.3 U?m L-1。最终筛选到了一条适合L-ASN基因表达的信号肽wap A。使用该信号肽,L-ASN胞外酶活达到32.3 U?m L-1,约是自身信号肽表达时的2.04倍。(3)重组L-ASN的酶学性质经过硫酸铵沉淀、疏水柱一步纯化,从重组菌发酵上清中纯化得到了电泳纯的L-ASN。重组L-ASN的最适反应温度为60°C,在60°C的T1/2为42.6 h,DSC分析得到Tm值为70.2°C;最适反应p H为7.0,在p H 6~9范围内,酶活能够保持在90%以上;Km和kcat值分别为2.35 mmol?L-1和274 min-1;金属离子Cu2+、Al3+、Fe3+、Sn2+对L-ASN活性抑制作用较大,Ca2+和Mg2+对L-ASN活性有一定的促进作用,EDTA、Zn2+、Co2+、Ba2+、Ni+、Li+、Na+和K+对酶的活性影响较小。(4)重组菌WB-H10的等离子体诱变及突变株的发酵通过常压室温等离子体诱变重组菌筛选L-ASN产量提高的正向突变株。经高通量初筛及摇瓶复筛得到一株遗传稳定性好,且L-ASN产量提高30%的正向突变株。在摇瓶水平,通过单因素优化了发酵条件,确定了最优发酵培养条件(g?L-1):蔗糖65,蛋白胨20,尿素0.8,玉米浆15,K2HPO4 2.612,KH2PO4 2.041,Mg SO4·7H2O 1.845,Na Cl 3,L-天冬酰胺1,p H值为7;接种量3%。在3L罐上进行了突变株的发酵放大实验。通过溶氧控制、pH控制及补料分批发酵策略,进一步提高了L-ASN的酶活。3L发酵罐上L-ASN产量最高达到99.4 U?m L-1。生产强度为1.4 U?m L-1?h-1。