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[背景]神经管缺陷（Neural Tube Defects,NTDs）是由于胚胎发育早期神经管闭合不全导致的一组严重先天畸形。NTDs的病因十分复杂,其发病机制仍不完全清楚。已有研究提示,遗传因素在NTDs发生中起重要作用。平面细胞极化（PCP）信号通路是调控神经管闭合的重要通路之一,多种动物模型和人群测序研究报道了 PCP通路与NTDs的关系。然而,既往研究仅限于基于种系遗传的单核苷酸位点变异,且绝大多数检测到的人群变异使用的是胎儿血液或唾液DNA。而其他突变类型,如基于大片段变异的拷贝数变异（CNVs）和仅发生于特定部位的体细胞突变未有报道。越来越多的证据表明,基因拷贝数变异和体细胞突变在神经系统疾病的发生发展中起重要作用。[目的]研究目的包括:（1）在NTDs病例中筛选PCP通路关键基因的基因拷贝数变异位点,尤其是罕见的de novo基因拷贝数变异,探讨其与NTDs的关系;（2）检验中枢神经组织DNA的PCP通路基因的体细胞突变是否与NTDs发生有关。[方法]本课题包括两部分研究内容,采用人群测序、细胞实验和动物模型研究相结合的研究设计方法。第一部分:PCP通路基因基因拷贝数变异与NTDs（1）基因拷贝数变异筛选和验证本次研究选取PCP通路关键基因,包括:VANGL1、VANGL2、CELSR1、SCRIB、DVL2、DVL3和PTK7。采用CNVplex?高通量DNA拷贝数检测技术,对175例NTDs病例脐带组织进行基因拷贝数检测,初步筛选NTDs相关的CNVs。采用实时荧光定量PCR（qPCR）验证筛选到的CNVs。（2）罕见de novo基因拷贝数变异位点分析对于患儿的生物学父母,采用qPCR进行靶向CNVs检测。CNVs仅发生于胎儿DNA,而不发生于父母DNA时,定义该突变为新生突变,即de novo突变。将在本NTDs人群中筛选到的de novo CNVs位点频率与其在公共对照数据库和本研究纳入的本地对照人群中的频率进行比较。采用Pearson χ2检验分析病例组和对照组间CNVs频率差异。当病例中该拷贝数变异的频率显著大于以上对照人群时,提示其为NTDs发生的危险因素。第二部分:PCP通路基因体细胞突变与NTDs（1）人群研究本研究以PCP通路基因为目标基因,包括两部分:1)PCP通路已有人群种系突变报道的关键基因,包括CELSR1、DACT1、DVLs、FZD6、PRICKLE2、SCRIB、和VANGLs;2)在小鼠动物模型中已经报道该基因突变可出现NTDs表型,但在NTDs人群中尚无报道的基因,包括:CDX1、CDX2、CTHRC1、FZD1、FZD2、MED12、SFRP1、SFRP2、SFRP5、SMURF1、SMURF2。收集48例NTDs患儿的神经系统病变处和脐带组织 DNA,采用 Ion Torrent Personal Genome Machine（PGM）测序,筛选 PCP通路NTDs相关体细胞突变位点,将病变组织检测到而非病变组织未检测到的突变定义为体细胞突变;采用Sanger测序验证筛选到的位点,并进一步纳入同一个患儿的由外胚层发育来的表皮、由中胚层发育来的心脏和肌肉组织、由内胚层发育而成的胸腺和肺组织进行测序,探讨体细胞突变在不同胚层的器官中的分布;此外,为进一步确认突变是发生于胎儿体内而非从双亲遗传得到,纳入携带体细胞突变的患儿父母血液标本进行Sanger测序。（2）细胞功能实验针对经过Sanger验证和生物信息分析后纳入的目标突变,构建野生型和突变质粒。采用免疫荧光染色法检测突变位点对蛋白亚细胞定位的影响;采用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达;采用荧光素酶报告系统检测突变位点对于经典/非经典WNT信号通路的影响;采用活细胞成像技术检测突变位点对于细胞迁移的影响。（3）小鼠基因敲除模型采用6周龄雌性C57BL/6小鼠构建CRISPR/Cas9小鼠模型。将6周龄雌性小鼠与雄鼠合笼受孕后第二天将受精卵取出,在37℃,5%CO2的培养箱中培养2小时。将Cas9 蛋白（20ng/μL）、Med12基因的 sgRNAs（10ng/μL）和Med12单核苷酸链（10ng/μL）混合液采用显微注射技术注入受精卵,将注射后的受精卵转移回雌性小鼠体内。在胚胎发育第12.5天解剖小鼠,检查胚胎畸形并记录神经管缺陷表型等相关表型。[结果]第一部分:PCP通路基因基因拷贝数变异与NTDs（1）CNVs筛选和验证:在175例患儿中,通过CNVplex检测,筛选到了位于5个基因上的16个CNVs位点,其发生于11例NTDs患儿中。该16个CNVs中,DVL2第1-15外显子发生了重复突变,其他15个则为缺失突变。采用qPCR技术,11个CNVs经过了验证。其中,DVL2第1-15外显子重复突变在无脑患儿中得到验证;VANGL1第1-7外显子缺失突变分别在两个脊柱裂患儿中得到验证;VANGL1第8外显子的缺失突变分别在8个NTDs患儿中得到验证。（2）罕见de novo基因拷贝数变异的分析:对携带已验证CNVs的患儿父母血液测序,发现VANGL1第1-7外显子缺失突变和DVL2第1-15外显子重复突变在父母血液中缺失,仅发生于胎儿,提示为de novo突变。在公共CNVs数据库中检索以上两个位点发现其在对照数据库中频率小于0.01%,提示其为罕见突变。与对照数据库比较,在本NTDs人群中,VANGL1外显子1-7缺失突变的发生率为1.14%,DVL2第1-15外显子重复突变发生率为0.57%,均显著高于其在正常人中的频率（P<0.05）,表明VANGL1和DVL2的罕见de novo基因拷贝数变异在NTDs中具有聚集性。第二部分:PCP通路基因体细胞突变与NTDs（1）人群研究PGM测序技术在48例NTD患儿的神经系统病变处组织共筛选到位于15个PCP通路基因上的27个体细胞突变位点,其中17个属于有害突变;10个PGM测序突变等位基因检测频率高于40%;16个在正常人群中暂无报道,为新发突变,其余11个在正常人群中为罕见突变。进一步Sanger测序,有10个位点经过了验证,进一步探究该10个突变位点在不同组织器官中的分布,结果表明,目标突变在来自不同胚层的不同组织中表现分布情况各异,其中CELSR1 c.6375G>c、DACT c.1192 C>T、DVL2 c.1195A>G、FZD6 c.1991A>C、FZD6 c.262C>G、VANGL1 c.1121G>A 和 MED12 c.5344C>T突变仅发生在NTDs患儿的神经系统病变组织中,其他组织器官均未检出。对于以上体细胞突变位点进行生物学分析后,发现FZD6 c.262C>G（p.Gln88Glu）,VANGLl c.1121 G>A（p.Arg374His）,MED12c.5344C>T（p.Arg 1782Cys）可能影响蛋白功能,因此进行后续细胞功能实验加以验证。（2）细胞功能研究FZD6 p.Gln88Glu突变影响FZD6蛋白定位,并且影响FZD6与CELSR1蛋白相互作用,阻碍其共定位到细胞-细胞接触点。此外,FZD6 p.Gln88Glu可影响FZD6对于非经典WNT信号通路的调控,导致非经典WNT信号通路表达上调。VANGL1 p.Arg374His突变影响VANGL1蛋白和CELSR1蛋白相互定位到细胞-细胞接触点,并可以上调VANGL1蛋白水平,导致细胞迁移速度和距离增加。MED12 p.Arg1782Cys突变导致MED12蛋白水平下降,升高经典WNT信号通路表达,从而影响细胞功能。（3）小鼠基因敲除模型人群突变MED12p.Arg1782Cys位点在小鼠中同源突变位点为Med12 p.Arg1784Cys,采用CRISPR/Cas9技术构建Med12p.Arg1784Cys小鼠突变模型。将Med12靶向sgRNA,Med12单核苷酸链和Cas9蛋白复合物,注入受精卵中。进行两次注射后,将192个胚胎植入6个受体小鼠中（每个受体携带32个胚胎）,在胚胎发育12.5天处死母鼠,共收集到12和活胎和1个死胚。活胎中,10个为雄性,2个为雌性。两个雄性胎鼠基因型为Med12 p.Arg1784Cys/Y,其余均为野生型。2个Med12 p.Arg1784Cys/Y小鼠均表现出严重的露脑畸形、尾部脊柱裂、卷尾等神经管缺陷相关表型,表明Med12 p.Arg1784Cys突变可导致小鼠NTDs表型,为人群发现提供了有力证据。[结论]1.PCP通路关键基因VANGL1和DVL2基因的罕见de novo基因拷贝数变异与人类NTDs的发生有关。2.中枢神经系统组织PCP通路相关基因VANGL1、FZD6、MED12等的体细胞突变是NTDs发生的遗传机制之一。