随着社会进步和科技发展,生物分析已渗透于生物、化学、医药学、食品及工业等各个领域当中。生物分子(如核酸、蛋白质、酶和生物小分子等)的检测已成为生物分析领域的研究热点之一。几十年来,人们越来越致力于发展和完善更灵敏、更准确、更便捷、更经济的生物传感技术,以满足各个领域越来越高的要求。其中,信号放大荧光生物传感技术是近年来发展起来的一种利用各种核酸工具酶和纳米粒子等方法,并结合荧光检测技术而建立起来的高灵敏度检测方法。然而,目前信号放大荧光生物传感技术大多存在多标记、过程复杂等缺点。如何改进和发展新的信号放大荧光传感技术,是生物医学和化学工作者所面临的科学问题。本论文基于以上问题,以核酸和核酸酶为分析对象,利用滚环扩增技术、酶辅助循环放大和纳米粒子技术,建立了一些简便、灵敏、快速的生物分子荧光信号放大检测方法。全文共分为以下六章:第一章为绪论,简要介绍了生物传感的原理和特点,阐述了荧光生物传感的分类和传感机制,重点综述了信号放大荧光生物传感的近期研究进展,最后对本论文的研究目的和意义作了简述。第二章为线性DNA探针代替发夹式探针构建滚环扩增荧光生物传感灵敏检测DNA。本研究工作,将滚环扩增技术与荧光共振能量转移相结合,建立了一种简单的超灵敏检测DNA的均相荧光分析法。该方法中,将荧光素FAM和猝灭剂BHQ1分别标记在两条ssDNA3’和5’末端上,设计出线性单标记的DNA探针,用来代替双标记的发卡式探针(分子信标),检测目标DNA。比较了这两种DNA探针的分析性能,发现线性DNA探针能够有效避免相邻信号探针分子之间的荧光共振能量转移,从而提高滚环扩增荧光法的灵敏度。对于目标DNA分子的测定,该方法表现了高的灵敏度,检出限为0.7 aM,其灵敏度比分子信标为信号探针的灵敏度高100倍。方法简便、易操作,无需繁琐的分离、洗涤步骤,在疾病相关的早期诊断中有潜在的应用价值。第三章为基于光诱导电子转移的滚环扩增荧光猝灭法检测miRNA的研究。本研究工作中,在锁式探针中设计了 "-CCC-"序列,从而在滚环扩增产物中就会对应生成含有"-GGG-"的序列。当滚环扩增产物与FAM标记的DNA探针杂交反应后,G碱基与FAM之间就会发生光诱导电子转移,从而对目标miRNA进行高灵敏的检测,其检出限为6 aM。本法只需单标记的线性DNA探针,不需要特异标记荧光猝灭基团,为简化实验方法和提高方法的灵敏度提供了新的思路。第四章为基于核酸外切酶Ⅲ辅助目标循环放大和脂质体信号放大的一步双放大荧光生物传感检测DNA的研究。本章中,提出了一种可用于DNA超灵敏检测的双信号放大新策略。实验设计并合成了一种哑铃型的探针,该探针具有目标分子识别功能、磁性分离功能和信号输出的功能。当DNA目标分子存在时,多功能的哑铃型探针能够引发核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助的目标循环放大反应,同时生成大量包裹了荧光素(FAM)的脂质体。该方法一方面以脂质体中荧光素的大量释放为放大手段,另一方面结合了目标循环放大法,因此具有较高的灵敏度。该方法检测DNA的检出限可低至4 aM,远低于单纯的Exo Ⅲ辅助的信号放大技术。另外,在该传感体系中,双信号放大过程能够一步完成,简化了实验操作,缩短了实验时间。该简便、快速、超灵敏的检测方法在疾病早期诊断、生物分析等领域中有良好的应用前景。第五章为基于酶催化合成dsDNA为模板原位形成铜纳米簇(CuNCs)的荧光生物传感灵敏检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。在DNA引物的存在下,TdT可以催化底物dATP和dTTP随机的聚合在引物的3’端,最终形成由A碱基和T碱基组成的dsDNA,此dsDNA可以用作模板合成强荧光的CuNCs,据此建立了一种简易且灵敏的检测TdT活性的荧光新方法。该方法的线性范围为0.7 U/μL至14 U/μL,检出限为0.06 U/μL,并用于急性淋巴白血病细胞中TdT活性的测定。本研究工作主要利用目标分子引发dsDNA的形成,以及强荧光CuNCs的原位制备。这种非标记方法无需设计复杂的DNA序列或荧光染料标记物,且整个分析过程是在同一份溶液中完成的,无需分步操作,方法简便,选择性高。该方法不仅提供了一个测定TdT活性和抑制性的荧光生物传感平台,而且在生物学研究、药物开发和临床诊断方面有重要的应用价值。第六章为dsDNA功能化的磁性微球为探针高灵敏检测核酸内切酶EcoRI活性。本章研究对比了分别以不同A、T碱基序列的dsDNA、任意碱基序列的dsDNA与聚T的ssDNA为模板合成的CuNCs的荧光强度,发现由A、T碱基交替排列组成的dsDNA合成的CuNCs荧光最高。故在此dsDNA的一段加上EcoRI的特异性识别序列,然后再连接到磁性微球的表面,从而设计出检测EcoRI的探针。当有EcoRI存在时,EcoRI识别并剪切其切割位点,将dsDNA释放到溶液中,然后收集溶液中的dsDNA,并以其为模板合成荧光CuNCs,从而对EcoRI进行了活性检测,其检出限为3×10-4U/μL。方法简单、快速,而且无需有机荧光染料,是一种环境友好的绿色分析方法。